孕妇外周血胎儿细胞的富集技术及其在产前诊断中的应用 _医学论文.doc免费

孕妇外周血胎儿细胞的富集技术及其在产前诊断中的应用 _医学论文 孕妇外周血胎儿细胞的富集技术及其在产前诊断中的应用 _医学论文 羊膜穿刺和绒毛吸取是目前常用的产前诊断技术，但其操作具有创伤性，可导致宫内感染、羊膜破裂、流产、胎儿畸形或死亡等［1］。建立非创伤性产前诊断方法，降低产前诊断的风险，是产前诊断工作的一项重大课题。自50年代从孕妇外周血中发现胎儿细胞后，学者们开始关注这类细胞在产前诊断中的应用价值，但因技术条件的限制，这一非创伤性诊断方法进展缓慢。直至80年代中期，随着胎儿细胞分离技术的日趋成熟和分子生物学、细胞遗传学诊断技术的迅猛发展，这一产前诊断方法才有了新的突破，并成为近十年来众多学者研究的热点，现综述如下。 　　1　胎儿细胞的特征和消长规律 　　1.1　类型 　　目前从孕妇外周血分离到的胎儿细胞有滋养叶细胞、淋巴细胞和有核红细胞(NRBC)。因滋养叶细胞体积大、容易在肺组织滞留；淋巴细胞出现晚，存活时间长(半年～27年)，在下次妊娠时妇女血液中可再次出现［2］，其应用价值不大。 　　NRBC是用于产前诊断最理想的胎儿细胞，它有如下特征：(1)可在妊娠早期出现，寿命短(不超过90天)，便于早期诊断［3］；(2)可表达出特殊的抗原成分，便于富集；(3)可发生特殊的血红蛋白反应，便于鉴定［4］；(4)携带胎儿全部基因组，便于遗传学和分子生物学分析。 　　1.2　抗原性 　　胎儿细胞的抗原性是鉴定、富集胎儿细胞的生物学基础，现已证实，胎儿NRBC有4种特殊的抗原成分：转铁蛋白受体(CD71)、凝血酶敏感蛋白受体(CD36)、糖蛋白A(GPA)和红细胞膜蛋白［5-7］。最近Steele等［8］又从孕妇外周血中发现HLA-G mRNA基因信号，提示HLA-G很可能是胎儿NRBC的另一抗原标志。 　　1.3　消长规律 　　探讨胎儿细胞的消长规律有助于选择产前诊断的最佳时间。Tomas等［9］发现人工受精的妇女血液检出Y染色体特异性序列的时间为4周零5天，最迟50天，首次检出的平均时间为6周±4天，消失时间为产后2个月。Simpson等［10］研究发现，从孕妇外周血分离胎儿NRBC的最佳时间为妊娠后10～18周。马旭等［11］发现19例妊娠男胎妇女外周血Y染色体锌指蛋白基因(ZFY)在妊娠6周、11周、14周时的检出率分别为5.3%、68.4%和95.0%，同时还发现妊娠女胎的妇女外周血无1例ZFY假阳性，提示分离胎儿NRBC进行产前诊断的最佳时间为妊娠14周。 　　1.4　含量 　　胎儿NRBC含量高低关系到产前诊断的准确性。众多的研究表明，胎儿细胞与母体在细胞之比为1∶5000～1∶20 000，其中胎儿NRBC的比例在1∶105～1∶109之间。从理论上，只要有理想的富集、分析方法，胎儿NRBC含量完全可以满足诊断需要。 　　2　胎儿细胞的富集 　　纯度和产量是衡量胎儿细胞富集效力的两个重要概念，纯度是指分离后样本内胎母细胞百分比，产量是指实际获得的胎儿细胞数，不同方法对富集胎儿细胞的纯度和产量有很大影响，现就现有的富集方法分述如下。 　　2.1　密度梯度离心法 　　利用聚蔗糖与泛影酸钠混合物作分离介质，加至孕妇血中离心，根据细胞密度的差异分离出胎儿细胞。该法简便易行，但胎儿细胞的纯度和产量不高。宋杰等［12］用此法分离胎儿细胞预测胎儿性别的灵敏度和特异度分别为84.85%和96.77%，总符合率为90.63%。 　　2.2　γ珠蛋白阳性选择法 　　胎儿血红蛋白主要为HbF，而成人为HbA。HbF由两条α珠蛋白和两条γ珠蛋白链组成；HbA由两条α珠蛋白和两条β珠蛋白链组成。利用抗γ珠蛋白的单克隆抗体通过流式细胞计数仪可富集胎儿NRBC。Zheng等［3］证实83%～100%抗γ珠蛋白阳性细胞为孕妇血液中的胎儿细胞。 　　2.3　荧光激活细胞分类法 　　又称流式细胞计数仪分离法 。先制备单核细胞悬液，用荧光素激活胎儿NRBC，利用流式细胞计数仪将胎儿NRBC从孕妇血液中分 离出来。Bianchi等［5］用荧光素标记抗CD71、CD36、GPA抗体后分离胎儿NRBC，再用PCR进行Y染色体序列分析，发现单独用抗CD71、CD36富集胎儿NRBC诊断胎儿性别的准确度分别为57%和88%，而单独用抗GPA或同时使用抗CD71、CD36富集胎儿NRBC诊断胎儿性别的准确度为100%。Wachtel等［14］和国内学者李智等［15］研究也有相似的结论。提示使用的抗体不同对分离胎儿细胞的纯度和产量有很大影响。 　　2.4　磁性激活细胞分类法 　　利用磁珠吸附胎儿NRBC，在磁场作用下将胎儿NRBC从孕妇血液中分离出来，包括以下两种方法。 　　2.4.1　磁场正相富集　又称磁场阳性富集。孕妇血液经密度梯度离心制备单细胞悬液，加入磁珠标记