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尾加压素Ⅱ促进乳鼠心肌成纤维细胞分泌胶原及增殖的细胞内信号转导机制_医学论文 尾加压素Ⅱ促进乳鼠心肌成纤维细胞分泌胶原及增殖的细胞内信号转导机制_医学论文 作者：宋庆刚，吕建庄，杨竞霄 【摘要】 目的 探讨尾加压素Ⅱ(UⅡ)促进乳鼠心肌成纤维细胞(CFs)分泌胶原及增殖的细胞内信号转导机制。方法 体外培养CFs，采用免疫组织化学染色法及羟脯氨酸测定法分别观察不同浓度UⅡ作用下，CFs中磷酸化ERK1/2细胞灰度和CFs培养上清中胶原含量的变化；蛋白激酶C(PKC)抑制剂chelerythrine chloride(Che)、ERK1/2抑制剂PD98059和钙调神经磷酸酶(CaN)抑制剂cyclosporin A(CsA)各自对UⅡ诱导的细胞增殖的影响。结果 在1×10-10、1×10-9、1×10-8mol/L UⅡ作用下，CFs培养上清中胶原含量均较对照组明显增加，而CFs中磷酸化ERK1/2细胞灰度均较对照组有显著降低(0.01)；在1×10-7 mol/L UⅡ作用下，上述各参数与对照组比较无统计学意义(Pgt0.05)。1×10-6mol/L Che+1×10-8 mol/L UⅡ组、1×10-5mol/L PD98059+1×10-8mol/L UⅡ组和5μg/mL CsA+1×10-8 mol/L UⅡ组的胶原含量均高于对照组而低于1×10-8mol/L UⅡ组(0.05)。1×10-6 mol/L Che+1×10-8 mol/L UⅡ组、1×10-5mol/L PD98059+1×10-8 mol/L UⅡ组和5μg/mL CsA+1×10-8mol/L UⅡ组的pERK1/2的灰度低于对照组(0.01)；1×10-6mol/L Che+1×108mol/L UⅡ组和5μg/mL CsA+1×10-8mol/L UⅡ组的pERK1/2的灰度高于1×10-8 mol/L UⅡ组(0.01)，而1×10-5mol/L PD98059+1×10-8mol/L UⅡ组与之比较则无统计学意义(Pgt0.05)。结论 UⅡ具有促进CFs分泌胶原及增殖的作用，其作用可能是通过PKC/MAPK/CaN途径实现的。 【关键词】 尾加压素Ⅱ；心肌；成纤维细胞；细胞分裂 尾加压素Ⅱ(urotensin Ⅱ，UⅡ)是一种生长抑素样环形结构的神经肽，最早提取于硬骨鱼的尾部下垂体，1998年首次在人体中克隆成功[1]。UⅡ广泛存在于神经系统和心血管系统，属于神经内分泌肽，其特异性受体为孤儿G蛋白耦连受体GPR14[24]。文献报道，UⅡ是迄今为止发现的最强的血管收缩剂，比内皮素强10余倍，对心血管系统的调节有着重要的作用。但UⅡ对CFs分泌胶原及增殖的影响及其影响机制尚不清楚。本研究是在体外培养CFs，再采用免疫组织化学染色法及羟脯氨酸测定法，分别观察加入蛋白激酶C(PKC)抑制剂chelerythrine chloride(Che)、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)抑制剂PD98059和钙调神经磷酸酶(CaN)抑制剂cyclosporin A(CsA)对UⅡ诱导的CFs细胞增殖及胶原合成的影响，旨在探讨UⅡ诱导的CFs细胞增殖作用和胶原合成的细胞内信号转导机制，从而在细胞及分子水平上为心肌纤维化的发生提供新的理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物、试剂及仪器 　　SD乳鼠购自本校实验动物中心。 Rat UⅡ、DMEM、DAB显色剂、碘化丙啶、兔pERK1/2蛋白多克隆抗体、Che、PD98059和CsA均为Sigma产品；胎牛血清(FCS)购自浙江杭州靖湖犊牛利用研究所；大鼠抗兔二抗ABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司；羟脯氨酸含量测定试剂盒购自南京建成生物公司；链霉素抗生物素蛋白过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒购自福州迈新生物公司；台盼蓝购自西安化学试剂厂。3550型自动酶联检测仪为美国Beckman公司产品，721型可见光分光光度计为上海第三分析仪器厂产品。 　　1.2 CFs的培养和鉴定 　　在无菌环境下取出生2-3d的SD仔鼠心室，剪碎，DMEM冲洗，用0.7g/L胰酶消化细胞，每10min收集一次细胞，收集4-6次，筛网过滤，1000r/min离心4-5min，将收集的细胞采用差速贴壁法分离纯化CFs。待CFs生长近融合时以1∶2传代。经倒置显微镜、透射电镜确认，SABC法免疫组化染色，纤维粘连蛋白染色阳性、血管平滑肌肌动蛋白VⅢ因子和结蛋白染色阴性证实所培养的细胞为CFs。实验采用2-4代细胞。 　　1.3 CFs培养上清中的胶原含量测定 　　采用羟脯氨酸比色法测定。将对数生长期的CFs用2.5g/L胰蛋白酶消化，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度为2.5×107