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携带人白细胞介素18基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建、鉴定和滴度测定_医学论文 携带人白细胞介素18基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建、鉴定和滴度测定_医学论文 作者：毛立军，郑骏年，郑典宝，郝林，郑宏祥，裴东生 【关键词】白细胞 　　摘要:目的构建人白细胞介素18（IL-18）基因复制缺陷型腺病毒表达载体。方法以质粒pJWIL-18为模板，设计并合成上、下游引物，利用多聚酶链反应（PCR）扩增获得IL-18基因片段，酶切后克隆至pCA13质粒，构建重组质粒pCA13IL-18。鉴定正确后，将pCA13IL-18与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染HEK293细胞，9～12天出现病毒空斑。提取重组腺病毒的DNA，进行PCR鉴定。大量扩增后，氯化铯梯度离心纯化腺病毒，测病毒滴度。结果酶切分析、序列测定、PCR验证表明，IL-18基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体中。结论成功构建了表达人IL-18基因的复制缺陷性腺病毒载体。 　　关键词:白细胞介素18腺病毒载体 　　Abstract:ObjectiveToconstructthereplication-deficientrecombinantadenovirusesvectorexpressingIL-18gene.MethodsTogethumanIL-18templateDNAsequences，onepairofspecificprimerstohumanIL-18geneweredesignedandsynthesizedandusedtoamplifyIL-18cDNAbypolymerasechainreaction（PCR）usingpJWIL-18asthetemplate.ThePCRproductwasdigestedwithEcoRⅠandBamHⅠandinsertedintoplasmidpCA13toconstructtherecombinantplasmidpCA13IL-18，whichwasthenidentifiedandwascotransfectedtogetherwithpBHGE3intoHEK293cells，wheretheviralplaquesappeared9-12dayslater.Therecombinedadenoviruseswereverified，purified，propagatedonHEK293cells，andpurifiedbyCsCIgradientaccordingtostandardtechniques.Finally，thefunctionalPFUtitersweredeterminedbyplaqueassayonHEK293cells.ResultsTheevidencesofendonucleasedigestion，DNAsequencingandPCRanalysisconfirmedthathumanIL-18genewascorrectlyinsertedintothereplication-deficientrecombinantadenovirusesvector.ConclusionRecombinantadenovirusesvectorexpressinghumanIL-18genehasbeensuccessfullyconstructedasapotentiallyusefultoolforinvestigatingtheanti-tumorroleofIL-18. 　　Keywords:interleukin-18adenovirusvector 　　白细胞介素18（IL-18）又称干扰素-γ诱导因子（interferonγ-inducingfactor，IGIF），是Okamura等［1］在中毒性休克小鼠肝脏中克隆到的一种蛋白。IL-18通过诱导干扰素（IFN）产生、增强自然杀伤细胞（NK细胞）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性、诱导Th1细胞分化增殖、抑制肿瘤血管生成等多种生物学功能，发挥其抗肿瘤作用［2］。复制缺陷型腺病毒载体以其高安全性，而成为目前肿瘤基因治疗研究中应用最多的载体。我们通过构建表达人IL-18基因的复制缺陷型腺病毒载体，以期为进一步将IL-18应用于抗肿瘤研究奠定基础。 　　1材料和方法 　　1.1材料和试剂 　　1.1.1菌株、细胞和质粒感受态大肠杆菌JM101由徐州医学院生物化学教研室保存，pJWIL-18质粒由徐州医学院生物化学教研室裴冬生老师惠赠，HEK293细胞、pCA13质粒、pBHGE3质粒由中国科学院生物化学和细胞研究所刘新垣院士惠赠。 　　1.1.2主要试剂各种常规限制性内切酶、T