瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴母细胞系的建立方法及意义_医学论文.docVIP

瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴母细胞系的建立方法及意义_医学论文 瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴母细胞系的建立方法及意义_医学论文 【摘要】目的:探讨建立瘢痕疙瘩家系永生化细胞库的方法，为研究瘢痕疙瘩的发病机制、诊断和治疗提供长期的标本来源.方法:采用CysA法、微量全血法和冻存全血法3种不同方法建立B淋巴母细胞样细胞系（B），比较各方法建系成功率及时间.结果:成功建立了一瘢痕疙瘩家系的永生细胞株，其中CysA法、微量全血法和冻存全血法转化的成功率分别为96.4%，46.4%，28.6%；建立细胞系平均所需时间分别为28.8d，39.7d，46.3d.结论:CysA法成功率高，建系所需时间短，是建立B最可靠的选择. 【关键词】瘢痕疙瘩家系EB病毒B淋巴细胞 　　0引言 　　瘢痕疙瘩的诊断和治疗是整形外科领域研究的重点和难点之一.近年研究表明，瘢痕疙瘩的形成具有明显遗传倾向，故我们拟以东北一瘢痕疙瘩家系为对象进行相关遗传学研究.为有效的保留此家系的DNA资源，我们采用EB病毒（Epstein）转化技术，分别用环孢霉素A（CysA）法、微量全血法和冻存全血法将样本外周血B淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系（lymphoblastoidcelllines,LCL），建立了此家系的外周血淋巴细胞永生细胞库，并对此3种转化方法进行了比较和评价. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　产生EBV的B95细胞株由中国医学科学院遗传与发育生物学研究所徐玖瑾教授馈赠，RPMI1640培养基（Gibco公司）；特级胎牛血清（HyClone公司）；淋巴细胞分离液，环孢霉素A及二甲基亚砜（Promega公司）；FITC标记的鼠抗人CD19mAb和PE标记的鼠抗人CD23mAb及同型对照（法国ACOULTER公司）.此瘢痕疙瘩家系来自我国东北，所有成员均有完整详细的资料.共采集了包括先证者所在核心家庭及发病人数较多的一个家庭共4代28个成员的外周血标本，男女比率3∶4，年龄3～76岁，其中瘢痕疙瘩患者5例，病程10～30a不等.所有血样都在无菌条件下抽取，常温带回实验室. 　　1.2方法 　　1.2.1EBV悬液的制备 　　复苏B细胞株，加入无血清RPMI1640，1000r/min离心10min，弃上清，加入RPMI1640完全培养基培养.每2～3d半量加液1次，待细胞数达到1×1010/L时，饥饿细胞4～7d，收集上清液，-70℃及37℃反复冻融3次，1800r/min离心15min，0.22μm滤膜抽滤，-70℃冰箱保存备用. 　　1.2.2CysA法 　　取5mL肝素抗凝血，室温放置24h，加入2mL无血清1640培养液，混匀，沿管壁小心加在4mL淋巴细胞分离液上，2500r/min离心30min，将白细胞层轻轻吸出后移入另一试管中，加入10mL无血清1640培养液洗涤3次，然后将洗涤后的白细胞用2mLRPMI1640完全培养基重悬，加入1.3mLEBV悬液和0.4mLCysA，充分混匀后等量移入2个10mL培养瓶内，置于37℃，50mL/LCO2培养箱培养；7d左右镜下观察,此后每周两次半量换液；约2wk后转瓶，继续培养、换液和传代.至细胞数达到(4～6)×109/L时，在完成染色体核型分析后可收集细胞进行冻存，建株完成. 　　1.2.3微量全血法 　　取0.1mL肝素抗凝血，直接加1.0mLEBV悬液及1mLRPMI1640完全培养基，置于37℃，50mL/LCO2培养箱培养；每周加0.5mLRPMI1640完全培养基.3～4wk后可在红细胞背景中观察到淋巴细胞体积增大，形似母细胞样的细胞团或单个细胞散在分布.此后每3～5d半量换液，直至红细胞及碎片基本清除，淋巴细胞大量增生. 　　1.2.4冻存全血法 　　取抗凝全血0.9mL，加入100mL/L二甲基亚砜（DMSO），混合后置-70℃低温冰箱2d内移至液氮中，每个样本冻存2～3支.1mo后，将冻存血标本从液氮中取出，置37℃水浴中迅速解冻，用10mL无血清RMPI1640培养液1000r/min离心2min，弃上清，留沉淀细胞；用2mL含RMPI1640完全培养基悬浮细胞，加入1mLEBV悬液，混合后移入10mL培养瓶内，置于37℃，50mL/LCO2培养箱培养，根据转化和细胞生长情况加液、换液、转瓶和传代. 　　1.2.5转化细胞株的冻存与复苏 　　细胞株在冻存前一天必须加新鲜的培养液，24h后收集细胞至离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，用1mL冻存液（950mL/L的胎牛血清+50mL/L的二甲基亚砜）重悬细胞，放置-70°C的冰箱1h后或隔夜进入液氮柜中保存.细胞复苏时迅速将冻存管放入37℃水浴，当冻存管中尚存有少量冰块(约0.4cm×0.3c