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病理技术新进展简介 反转录(Reverse transcript) 即依赖于RNA的DNA聚合作用。 PCR PCR技术的发展： RT-PCR mRNA cDNA 底物 dNTP(脱氧核苷三磷酸) PCR RT-PCR，即 Reverse transcript反转录PCR。 PCR PCR PCR技术的发展： RT-PCR 原位PCR(In situ PCR) PCR 原位PCR(In situ PCR)技术是继PCR技术之后又发展起来的一门新技术。是将PCR的高效扩增与原位杂交技术的细胞定位相结合，在组织切片或细胞涂片上原位对特定的DNA或RNA进行高效扩增再用特异性的探针作原位杂交检测。既能检出细胞内单拷贝及低拷贝的核酸序列，又能对含靶序列的组织细胞进行形态学分析。极大提高了在细胞原位检测核酸及抗原的敏感性。 PCR PCR技术的发展： RT-PCR 原位PCR(In situ PCR) 原位逆转录PCR(In situ RT-PCR) PCR 原位逆转录PCR(In situ RT-PCR) 是将逆转录反应和PCR结合，检测细胞内低拷贝mRNA．以mRNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板在DNA聚合酶作用下进行扩增，rTth逆转录酶具有分别依赖RNA或DNA的耐热I)NA聚合酶活性。可同时执行RT和PCR，使反应时间缩短。 PCR PCR技术的发展： RT-PCR 原位PCR(In situ PCR) 原位逆转录PCR(In situ RT-PCR) 实时荧光定量PCR PCR 实时荧光定量PCR： 开始阶段的PCR只局限于DNA的定性研究，实时荧光定量PCR的出现，才真正实现了PCR从定性到定量的飞跃。 基本原理：是在常规的PCR反应体系中加入荧光标记探针，通过荧光信号积累实时检测整个PCR进程，来实现其定量功能。 PCR 实践应用：实时荧光定量PCR在肿瘤学方面应用较广泛。 (1)检测微量残渣疾病：是提供血液肿瘤患者有效治疗方案的关键一步，可以根据不同患者在分子水平的不同反应来指导个性化治疗； (2)检测单核苷酸多态性(SNP)：单核苷酸是第3代遗传标记，即每一个核苷酸在任何一代人群中大约每1×l09个个体就会发生一次变异，此种方法可以检测其差异，将在未来分子诊断中起重要的作用； (3)监测基因表达：实时荧光定量PCR技术即可以定量又可以定性的监测基因表达的变化，从而确定其是否有差异性表达； PCR (4)甲基化的研究：实时荧光定量PCR在检测DNA甲基化方面更具有优越性，它避免了反应后的凝胶电泳，因而增加了灵敏度和通量； (5)实时荧光定量PCR技术还可以与显微镜切割技术或石蜡固定标本提取DNA技术相结合，使从石蜡固定的少量标本中提取完整的DNA并进行检测基因表达成为可能。 PCR 优点： (1)高特异性与准确性 (2)污染小 缺点： 价格昂贵。 放射自显影 原位杂交 PCR 流式细胞技术 组织芯片 诊断细胞学技术 图像分析技术与网络技术 其他技术 流式细胞术 基本概念： 流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。 流式细胞术 基本概念： 流式细胞术(Flow Cytometry， FCM):是利用免疫或荧光细胞化学的原理，以激光激发荧光，结合计算机处理信息和快速分拣系统进行定量检测。 用流式细胞仪对处于快速流动的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的检测技术。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。 流式细胞术 流式细胞术 优点： 1.测量速度快； 2.高通量 3.可进行多参数测量（可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义）； 4.是一门综合性的高科技方法（ FCM综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）； 5.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。 流式细胞术 局限性： 1.需要新鲜没有固定过的样品； 2.样品采集和样品制备的过程中可能有选择性的细胞丧失；