第三章、细胞生物学研究方法(上).pptVIP

第三章  细胞生物学研究方法 一部分光通过物体，经过衍射等发生偏离；另外一部分没有被衍射、折射的非偏离光，则均匀的投射于像平面上。偏离光与非偏离光之间的光程差约为1/4，但此时两者不会产生干涉。 如果显微镜的物镜与目镜之间加一个相位板（phase plate)，使其相差再增加1/4（合计光程相差达1/2），这时偏离光与非偏离光相遇，便产生明显的干涉（相互抵消），两种光波相遇形成的合成波的振幅为两者之差，光线明显变暗。 而标本的介质，只有非偏离光通过，不发生干涉。结果形成暗色的物和明亮的背景的图象。 利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼 可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透 明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强， 使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和 暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及 细胞内的某些细微结构。 利用较短波长的光使样品受到激发产生较长波长的荧光，用来观察和分辨样品中产生荧光物质的成分和位置。 根据激发光的路径不同，可将荧光显微镜分为透射式和落射式两种类型。 电镜与光镜的比较 电镜样品的染色 电镜图像的反差实质上电子密度的差异，它是由于样品不同部分之间电子散射能力的差异所产生的。 由于生物样品主要由C、N、O等元素构成，这些元素原子序数低，散射电子的能力较弱，在电子散射能力上没有明显的差异，因此需要经过染色来增加样品的反差。 利用重金属盐进行染色后，不同的结构成分上吸附不同数量的重金属原子，结合重金属较多的区域具有较强的电子散射能力，在电镜下呈现为电子密度的黑色，反之亦然。 为了使标本表面发射出二次电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出二次电子信号。  放射性化合物渗入活细胞； 培养后取样、固定,进行光镜或电镜切片； 在暗处把感光乳胶覆盖于切片上，存放在暗处； 在此期间,放射性同位素衰变使乳胶曝光后显影及定影。根据银粒所在部位，就可知道细胞中放射性物质的分布。 * 过程 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 2.等密度沉降 isopycnic sedimentation 用途：分离密度不等的颗粒。 原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。 特点： 介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。 力场比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。 二、流式细胞术 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。仪器称为流式细胞仪（flow cytometer）。 第三节 生物化学与分子生物学技术 Feulgen反应：脱氧核糖的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。醌基为发色团 。 脂溶染色法：借苏丹III染料溶于脂类而使脂类显色。 茚三酮反应：显示蛋白质。 金属沉淀法：如检测碱性磷酸酶的Gomori方法。根据反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，从而显示酶存在部位。 一、细胞化学成分的显示方法 二、免疫细胞化学 immunocytochemistry 是利用抗体同特定抗原专一结合的原理，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。 免疫荧光法（immunofluorescent technique）：如异硫氰酸荧光素、罗丹明等。 免疫酶标法（enzyme-labeled antibody method）：如辣根过氧化物酶。 酶 酶 底物 显色 三、分子杂交技术 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。 原位杂交（in situ hybridization）: 用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。 四、放射自显影技术 原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。 放射性分子与细胞内原有的未标记分子混和，因它们的化学性质相同，细胞就会不加分辨地利用。 一般用14C和3H标记。 常用3H-TDR来显示DNA， 用3H-UDR显示RN