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第四章 酶的分离与纯化 一、酶的分离 二、酶的精制 三、电泳 四、酶的浓缩 五、酶结晶 一般程序 1. 预处理和固液分离：加速固液相分离 2. 细胞破碎分离胞内产物 3. 初步纯化（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质 4. 高度纯化（精致）：除去与产物性质相似的杂质 5. 产品加工 一、酶的分离 （一）发酵液预处理 目的： 改变发酵液物理性质 尽可能使产物转入便于后处理的某一相中 去除部分杂质 1、发酵液的相对纯化 （1）无机离子的去除 Ca2+ 常用草酸 Mg2+ 三聚磷酸钠，生成可溶性络合物 Na5P3O10+Mg2+ =MgNa3P3O10+2Na+ Fe3+ 黄血盐[K4Fe(CN)6],形成普鲁(Fe4[Fe(CN)6]3)沉淀 3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3?+12K+ (2)杂蛋白质的去除 1）沉淀法 机理主要是破坏电荷。酸性溶液中与一些阴离子如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸等形成沉淀。碱性溶液中与一些阳离子如Ag2+ Cu2+ Zn2+ Fe3+ Pb2+等形成沉淀 2）变性法 蛋白质因变性导致溶解度下降而被除去。常见的如加热、大幅度调pH、加有机溶剂和表面活性剂等。 3）凝聚和絮凝 用Al2(SO4)3等凝聚剂使蛋白质胶体体系不稳定，通过相互碰撞发生凝集。形成的颗粒较细。 絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂（如聚丙烯酰胺类衍生物）的架桥作用下将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。形成的颗粒较粗，用量小，速度快。 4) 吸附法 (3)色素及其他物质的去除 活性炭：0.1-1.5% 离子交换树脂 如DEAE-纤维素从含酶溶剂中吸附色素物质时，可同时去除非活性蛋 白质 （二）细胞破碎 1、细胞壁与细胞破碎 2、细胞破碎的方法 1）机械法： 珠磨法（bead mill）实验室：Mickle捣碎机；中试：胶质膜处理；工业：高速珠磨机 高压匀浆法：大规模细胞破碎方法；对于酵母等难破碎及高浓度细胞可采用多次循环方法；丝状真菌、较小的G+菌，含有包含体（Inclusion body）的基因工程菌不宜用此法。 超声波法（Ultrasonication）：杆菌比球菌容易破碎； G-比 G+容易破碎；酵母菌不易破碎；实验室较常用的方法，样品温度？？ 2）非机械法：酶法、化学法、物理法 化学渗透法（chemical permeation）：改变细胞壁或细胞膜的通透性；TritonX-100：结合、溶解磷脂，破坏膜脂双层；EDTA：对G-菌外膜有破坏作用；有机溶剂：分解细胞壁中的脂类；变性剂：脲、盐酸胍与水中氢键作用。优点：选择性，易于固液分离。缺点：通用性差，效率低，毒性 （三）酶的提取（extraction） 1、盐溶液提取： 盐溶（salting in） 在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。 常用稀盐溶液（0.02-0.5mol/L）。 2、酸、碱溶液提取 3、有机溶剂提取 （四）离心分离 1、离心机种类 (1)常速离心机 最大转速≤8000 r/min,相对离心力（RCF)≤1×104g (2)高速离心机 1×104 r/min≤转速≤2.6×104 r/min, 8×103g≤RCF≤1×105g (3)超速离心机 转速≥2.5×104 r/min, RCF≥1×105g TGL-16M高速台式冷冻离心机 2、离心分离方法 （1）差速离心(differential centrifugation) （2）密度梯度离心(density gradient centrifugation) （3）等密度梯度离心(sendimentation equilibrium centrifugation) 3、离心条件 （1）离心力 相对离心力RCF=[1.12×10-5×rn2]×g （2）离心时间 （3）温度和pH （五）沉淀分离 1、盐析法 盐溶(salting in) 在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。 盐析(salting out) 盐浓度升高到一定程度，蛋白质和酶浓度随盐浓度的升高而不同程度下降并沉淀析出。 （1）盐析法的机制 （2）盐析用中性盐的选择 常用的中性盐：MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4和NaH2PO4 （3）(NH4)2SO4饱和度表示法 （4）影响盐析的因素 1）蛋白质浓度 2）pH和温度的影响 蛋白质的盐析 盐析应用最广泛的是硫酸铵 优点 1）溶解度大 25℃时硫酸铵的溶解度可达4.1mol/L(541g/L)以上。大约每升水可溶解767g之