第二章PCR技术.pptVIP

第二章 PCR原理及相关技术 1、基本原理 PCR包含两个重要方面：一是能合成DNA的特定序列；二是特定序列的迅速大量扩增。其原理类似DNA的体内复制，是以单链DNA为模板，利用DNA 聚合酶赖于DNA模板的特性，在附加的一对寡聚合苷酸引物之间催化合成互补链的过程。一般分三步进行： ①高温变性 ②低温退火 ③中温延伸 2、PCR技术的特点 ① 特异性强 ② 灵敏度高 以HBV为例，原体、抗体的检测灵敏为度ng/ml，核酸杂交为pg/ml, PCR法为fg/ml. ③ 简便快速 ④ 对样品要求低 一定的局限性 ① 单核苷酸错误掺入 ② 假阳性结果 ③ 假阴性结果 3、影响PCR的因素 ⑴ 模板 ⑵ 引物 ① 根据代测基因组的保守区序列设计引物，以保证引物与模板之间最大的同源； 同时避免与其它区有同源。 ② 引物本身长度以16—30bp为宜。 ③ G+C含量宜在40％—60％，碱基尽可能随机分布。 ④引物内部应避免二级结构，尤其是发夹结构。 ⑤两引物之间不应发生互补，尤其是在引物的3’端。 ⑥引物3’端与模板的配对必须精确、严格，末端碱基不要为A。 ⑦引物5’端可修饰FITC、Biotin 或 Digoxin，也可引入限制性酶切位点，不影响扩增效果。 引物的适宜浓度为0.1—1umol/L, 以0.4umol/L为好。 ⑶ 4×dNTPs ⑷ Mg2+ ⑸ DNA聚合酶 常用浓度为2.5U/100ul ⑹ 循环参数 变性温度和时间 退火温度 延伸温度和时间 循环次数 PCR相关技术 热启动PCR（hot start PCR） 巢式PCR 逆转录PCR 不对称PCR 多重PCR 荧光定量PCR PCR中常见问题的分析和解决： 在进行PCR时，有时会遇到一些问题，需改变各种影响PCR的参数及条件，以确保PCR的成功。 没有得到所希望的PCR产物 确认是否加入酶，检查酶是否有活性 DNA解链是否充分，测定一下变性温度是否准确 人工合成的引物是否准确 在未加入Taq酶以前，将反应系统90℃作用5-10分钟，使蛋白酶和核酸酶失活 对样品进行纯化处理 PCR产物在凝胶电泳中呈片状 减少Taq DNA聚合酶的用量 提高退火温度 降低Mg2+浓度 缩短退火时间及延伸时间 减少循环周期数 从凝胶中回收与预期分子量相同的DNA，进行再次PCR扩增 凝胶电泳中出现引物二聚体带 检查引物的3′端是否互补 重新设计较长的引物 适当增加模板DNA的量 降低引物的使用浓度 减少循环周期次数 提高退火温度 PCR产物特异性不够 提高退火温度 缩短退火时间及延伸时间 降低引物和Taq DNA聚合酶的用量 改变Mg2+浓度 PCR污染导致假阳性结果 严格隔离不同的操作区，且人员单向流动。 分装试剂，标记批号 规范操作，且各区物品专用，使用一次性手套，容器和吸头 设立防污染体系以及各种对照、质控 用稀酸（1mol/L HCI）擦试或254/300nm紫外线照射（30分钟）污染环境及器件。