微丝的观察.docVIP

实验 微丝的染色及形态观察 【实验目的】 掌握微丝的染色方法。 了解光镜和电镜下的微丝基本形态和结构。 了解细胞松弛素B对微丝的作用及原理。 了解考马斯亮蓝染料在细胞生物技术中的应用。 【实验原理】 真核细胞胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架（cytoskeleton），在维持细胞形状和运动方面具有重要作用。根据组成成分和组装结构的不同，分为微管（microtubule，MT）、微丝（microfilament，MF）和中间纤维（intermediate filament，IF）。微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。微丝由蛋白单体聚合形成，细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。细胞松弛素B对微丝的作用具有可逆性。 考马斯亮蓝R250（Coomassie brilliant blue,R250）可以染各种蛋白,使蛋白呈蓝色。在该实验中微管等蛋白结构在光镜下无法分辨。我们看到的主要是微丝组成的应力纤维。 体外培养的贴壁细胞应力纤维尤为发达，形态长而直，常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。 【实验用品】 1. 器具：CO2恒温培养箱、倒置显微镜、超净工作台、低速离心机、普通光学显微镜、恒温箱镊子、培养皿，载玻片、吸水纸2. 材料：盖片培养的成纤维细胞试剂：PBS (pH7.2)、1％TritonX-100溶液、 M-缓冲液、3％戊二醛固定 液、0.2％考马斯亮蓝染液、100μg/ml的细胞松弛素B、DMEM培养液。 【实验步骤】 1. 从三张培养好的成纤维细胞贴壁生长的盖片平皿中，在超净工作台内将一张盖片移入另一平皿中继续培养，用作对照。 在有两片盖片的平皿内，去除培养基，用PBS洗3次，再加100μg/ml 的细胞松弛素B 4滴于盖片上，继续培养半小时。 将用细胞松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理，另一张用培养 液洗五次（在平皿内换五次培养液，每次都要摇动），继续培养、观察。两小时后细胞形状恢复，接近正常。 对恢复的盖片与第一张没用药的盖片一同做染色处理。 染色处理： (1) 将需染色的盖片放入盛有PBS的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片，换液3次，每次3分钟，洗去培养液。 (2) 将盖片移入1％TritonX-100液处理25～30min，室温或37℃均可。以提取骨架以外的蛋白质，使骨架图像清晰。 (3) 立刻将盖片移入M-缓冲液，换洗3次，每次3min。M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用。 (5) 将盖片移入3％戊二醛固定10min。 (6) 将盖片移入0.2％考马斯亮蓝染液染液中，染色15min。然后小心地用自来水冲洗，空气干燥。 【结果与观察】 光镜观察，微丝聚集成的张力纤维束被染成蓝色，在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列；用细胞松弛素B处理的标本，由于微丝被破坏突起缩回。多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚合成微丝，细胞形状恢复正常。 光镜下观察被染成蓝色的微丝聚集成的张力纤维束（注意成纤维细胞中 微丝分布的特点）注意观察正常对照片与用药处理后的标本成纤维细胞形状的区别 观察用药处理后又洗去药的标本中细胞形态是否恢复正常 【注意事项】洗片时要轻柔，以免把细胞从载片上洗去。 恢复时间要足够，否则细胞不会恢复到未处理前的状态。 操作中应注意区分细胞盖片的正反面。 染色后应冲洗盖片背面，避免损伤细胞。 1％TritonX-100抽提蛋白时，注意避免抽提时间过长破坏细胞结构。 【思考题】 1．绘出三种不同情况下细胞中微丝的分布。 2．实验中设计对照组的作用及重要性？ 3． TritonX-100液、M-缓冲液、戊二醛及考马斯亮蓝在本实验中作用？