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PCR技术培训 疾病的诊断 几乎所有的疾病都是基因病 科学研究已证明，基因可以揭示疾病的本质，人类几乎所有疾病都直接或间接与基因有关，在某种意义上都是基因病， 基因（gene）：基因是有遗传效应的DNA片段，是控制性状的遗传物质的功能单位。遗传效应是指能转录为 mRNA，继而翻译为蛋白质，或转录为核糖体RNA．转运RNA的功能。 PCR技术 1985年美国人莫里斯（Kary Mullis）发明了一种模拟DNA体内复制过程，在体外复制特定DNA片段的方法，并将其命名为聚合酶链式反应（PolymeraseChain Reaction，PCR）。PCR可以在短时间内倍增极微量DNA （理论上说,仅有一个足够了）至百万或十亿倍，通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核酸，并具有很高的灵敏度和特异性，可用于微量核酸样品的检测。 PCR技术 PCR技术被科学界誉为生物技术领域最伟大的发明之一，美国人莫里斯在发明该技术不久就因此于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR及其相关技术于80年代末在国外开始应用：欧共体（现欧盟）、日本、美国相继把PCR这一基因诊断核心技术列入献血员筛查，美国食物与药品管理局已批准了60多种基因诊断试剂用于临床，美国国家疾病控制中心已把PCR技术列入疾病诊断的常规技术。 1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。 短柄圆环探针荧光PCR原理 荧光标记 荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。常用的有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白DsRed 、CY3、CY5、FAM及其它荧光报告基团 探针荧光标记及 荧光基团：如红色荧光Cy3和绿色荧光Cy5标记探针 淬灭基团常：用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL） 影响分子信标的主要因素 分子信标中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标的最主要因素。根据Foerster理论，荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。 另外，温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较低温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在较高温度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，从而发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温度取决于茎干区的长度、G-C含量和缓冲液的离子强度 试剂盒组成 1、痰DNA提取液 2、PCR反应液 结核引物1和2、结核探针、 TaqE、缓冲液（10mmol/L Tris-HCl） 、dNTP、内参照模板、内参照引物1和2、内参照探针、石蜡油 3、PCR增强剂：MgCl2 4、强阳性对照：结核杆菌阳性质粒（或卡介苗） 5、弱阳性对照：结核杆菌阳性质粒（或卡介苗） 6、阴性对照：超纯水 PCR反应特点 特异性强 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。 荧光PCR-TB检测试剂盒的生产工艺流程 试剂盒检测操作方法 所有用于临床诊断的PCR检测均 应在卫生部批准的临床基因诊断实验室进行 核酸分离提取 试剂配制 扩增及检测 实时荧光PCR结果判读 荧光PCR试剂盒检测结果 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应管的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即：threshold=10×sd cycle6-15.荧光域值设定在PCR扩增的指数期。  Ct值 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—Ct值。C代表cycle，t代表threshold，