农杆菌介导EMDH基因转化紫花苜蓿的研究.pdfVIP

农杆菌介导EMDH基因转化紫花苜蓿的研究 刘嘉 于翰超 玉永雄 （西南大学 重庆市北碚区 400716 ） 摘 要 ：本研究通过农杆菌介导的叶盘法将来源于大肠杆菌的光诱导型苹果酸脱氢酶 基因导入紫花苜蓿中，增强紫花苜蓿苹果酸的合成和分泌，达到解铝毒的作用。对紫花苜蓿 进行遗传转化操作获得了 29 株转基因植株，并对所获得的抗性植株进行 PCR 检测，结果其 中有 1 株为转基因阳性植株，再经 RT-PCR 检测验证，确认苹果酸脱氢酶（MDH ）基因在 转录水平进行了表达。在酶活性分析中，转基因植株的 MDH 活性较对照植株提高了 16%。 并且在没有铝胁迫的情况下转基因植株叶片中苹果酸的含量比对照植株提高了 1.6 倍；在 50 μmol/L 铝离子胁迫下转基因植株叶片中苹果酸含量是对照植株叶片含量的 3.4 倍。通过根 尖耐铝性测定及根系伸长试验证明了转基因苜蓿对铝毒具有一定的耐受性。20 μmol/L 铝 离子胁迫下，转基因植株相对生长量高于对照植株的根相对生长量。 关键词：农杆菌；耐铝毒；大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因；遗传转化；紫花苜蓿 紫花苜蓿是栽培利用最广泛的豆科牧草之一。而铝毒是酸性土壤中影响苜蓿生长的重要 限制因子。因而提高紫花苜蓿铝的耐受性是解决紫花苜蓿顺利引种到我国南方的关键之一。 根据 Koyama H 等（1990）的研究[5]，在酸性土壤中，根部分泌出过量的柠檬酸，草酸或者 苹果酸等有机酸以螯合土壤中磷酸铝等化合物中的铝等重金属离子，释放出磷酸根离子供植 物吸收利用[4]。遗传转化苹果酸脱氢酶既可以增强苹果酸的积累或流动，同时也可以增加 柠檬酸合成量。 本试验将构建好的光诱导型大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因植物表达载体转入苜蓿中，修饰其有 机酸代谢，提高苹果酸脱氢酶的活性，使苜蓿体内积累苹果酸，增加植物苹果酸的分泌量。 在质膜的外部螯合铝离子，阻止植物对铝的吸收，从而降低铝的毒害作用。 1. 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 植物材料 渝苜一号紫花苜蓿田间材料及无菌苗，均由本实验室提供。 1.1.2 农杆菌菌株，质粒及载体 农杆菌转化菌株为 Agrobacterium tumefaciens C58C1(pPMP90) 用于植物转基因操作。菌 种在-80℃甘油保存。 质粒中含光诱导启动子的大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因，带有潮霉素（Hyg ）选择性标记 基因。质粒由昆明理工大学构建，在-80℃保存。 LB RB Hyg Prbcs EMDH NosT Spe 图 1-1 植物表达载体的结构 Fig.1-1 Structure of vector 1.2 农杆菌介导法遗传转化紫花苜蓿 根据顾红雅主编的植物分子生物学一书中介绍的农杆菌介导的叶盘法多紫花苜蓿进行 遗传转化。 1.3 转化植株的 PCR 检测 1.3.1 改良 CTAB 法提取苜蓿基因组 利用改良 CTAB 法少量提取再生植株基因组，以备 PCR 扩增检测用。 1.4.2 PCR 扩增 以提取的抗性苜蓿植株叶片总DNA 为模板，以农杆菌菌株质粒为阳性对照，以未转化 的苜蓿总DNA 为阴性对照，以构建的苹果酸脱氢酶基因序列设计引物进行 PCR 扩增。 1.3.3 农杆菌菌落 PCR 用灭菌牙签挑取平板培养基中少量菌体装入含20 ul ddH2O的离心管中。98℃水浴15min 后，取出至室温。取 10μl 菌液作为菌落 PCR 的模板 DNA。其他条件均与植物基因组 PCR 反 应条件一致。 1.4 RT-PCR 检测外源基因的表达 利用异硫氢酸胍法提取上述结果呈阳性的植株总 RNA,用无 RNase 的DNase I 消化可能 存在的 DNA, mRNA 逆转录后,进行 RT-PCR ，电泳检查。 1.5 转基因苜蓿及对照植株的酶活性和苹果酸含量检测 根据张丽（2005