利用SSR、ISSR和RAPD技术构建苜蓿基因组DNA指纹图谱.pdfVIP

维普资讯 62— 67 草 业 学 报 第 13卷第 3期 6／2004 ACTA PRATACULTURAE SINICA Vo1．13．NO．3 利用SSR、ISSR和RAPD技术构建 苜蓿基因组DNA指纹图谱 魏臻武 (甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070) 摘要：在建立可靠 的苜蓿基因组DNA提取分离和PCR扩增技术体系的基础上，筛选具有稳定多态性位点的 RAPD、SSR和ISSR引物 ，建立苜蓿基因组DNA的SSR、ISSR和RAPD分子标记技术体系，并利用分子标记检测苜 蓿品种 (系)的DNA分子标记多态性，构建苜蓿品种的DNA指纹图谱 筛选出36个RAPD引物，8个SSR引物和12 个ISSR随机引物，通过PCR扩增在 55个国内外苜蓿品种 (系)中获得了182个RAPD多态性位点和丰富的SSR和 ISSR多态性位点，构建了55个苜蓿品种 (系)的SSR、ISSR和RAPD指纹图谱。结果表明，不同苜蓿品种(系)的SSR 多态性有较大差异；苜蓿品种ISSR指纹图谱多态性丰富，稳定性比RAPD强；可以通过2～3个引物鉴别我国主要 苜蓿品种和引进品种，SSR和ISSR指纹图谱可以更好地用于苜蓿品种鉴定和遗传多样性分析。 关键词：苜蓿；分子标记；DNA指纹图谱 ；SSR；ISSR；RAPD 中图分类号：$551．7 文献标识码：A 文章编号：1004—5759(2004)03—0062-06 遗传资源的开发和利用对促进苜蓿生产十分重要，遗传资源的有效利用是农业可持续发展的重要保证[】。遗 传资源搜集、保存和利用都要求对基因源或基因库的多样性进行鉴定。加强苜蓿种质资源研究，对于加快育成优 良苜蓿新品种具有重要的作用和意义。 利用分子标记技术建立DNA指纹图谱(fingerprint)是鉴别品种、品系和选择杂交亲本的有力工具 2【]。指纹 图谱具有高度的个体或基因型特异性，分辨率高、稳定可靠 ，能够准确鉴定生物个体和群体之间的差异。以DNA 多态性为基础的分子标记，已在种质资源遗传多样性分析、品种指纹图谱及纯度鉴定、作物遗传连锁图谱构建和 重要性状的标记定位等方面得到广泛应用。目前用于绘制植物DNA指纹图谱的标记技术主要有RFLP(限制性 片段长度多态性，restrictionfragmentlengthpolymorphism)、SSR(简单重复序列，simplesequencerepeat)、 AFIP(扩增片段长度多态性，amplifiedfragmentlengthpolymorphism)、RAPD(随机扩增多态性DNA，random— lyamplifiedpolymorphicDNA)及小卫星等。SSR和ISSR(简单重复序列间区，intersimplesequencerepeat)是第 2代基于PCR技术的分子标记技术，以基因组中简单重复序列 (SSR)两侧的保守序列为引物，对基因组总DNA 进行PCR扩增。和其他DNA分子标记相比，SSR标记具有数量丰富、信息含量高和重复性好等特点，并且SSR标 记覆盖整个基因组，呈现多基因特点，表现为共显性遗传[2“]。此外，SSR分析对DNA 的数量和纯度要求不高。IS— SR是简单序列重复间区的DNA序列，检测的是基因组中两个SSR之间的一段短的DNA序列上的多态性。利用 植物基因组中广泛存在的SSR序列，可以设计出不同植物共用的能够与SSR序列相结合的PCR引物，对两个相 距较近、方向相反的SSR序列之间的区段进行扩增。ISSR为随机引物，引物长度在20bps左右，因此可以采用与 常规PCR相同的条件，其稳定性~tRAPD好。ISSR标记呈典型的孟德尔式遗传，一般表现为显性或共显性 引。IS— sR标记已经在植物遗传和育种中广泛应用。 Brummer等[6]、Echt等[7]和李拥军等[8利用RFIP和RAPD等分子标记技术对苜蓿DNA的多态性进行了分 析。目前尚没有关于苜蓿SSR和ISSR指纹图谱