利用牙鲆鳃细胞系分离和培养淋巴囊肿病毒.pdfVIP

维普资讯 第 33卷 第 2期 青 岛 海 洋 大 学 学 报 33(2)：233～239 2003年 3月 JOURNAlOFOCEAN UNIVERSITYOFQINGDAO March，2003 利用牙鲆鳃细胞系分离和培养淋巴囊肿病毒 吕宏旭 汪 岷 李红岩 郭华荣 张士璀 包振民 周 丽 (中国海洋大学，1海洋生命学院；2水产学院，青岛266003) 摘 要 本文利用牙鲆鳃细胞系进行了养殖牙鲆淋巴囊肿病毒的分离及培养，并通过 电镜对培养细 胞中淋巴囊肿病毒的形态及感染循环进行了初步研究。将病鱼的淋巴囊肿组织无菌滤液接种牙鲆细 胞系，细胞出现了明显的细胞病变 (Cytopathiceffect．CPE)。电镜观察在培养细胞的胞质中有病毒 的包涵体，胞质中散在 6角形、5角形或圆形的病毒粒子．大小为 1OO～140nm之间。在感染细胞的线 粒体中也存在大量的病毒颗粒。 关键词 淋巴囊肿病毒；细胞培养 ；细胞系；牙鲆 中图法分类号 $941．41 文章编号 1001—1862(2003)02—233—07 淋巴囊肿病可在鲈鱼、真鲷和牙鲆等多种海水鱼中发生，发病率高达 80 。该病的病原是 淋 巴囊肿病毒(1ymphocystisdiseasevirus，LDV)，属虹彩病毒科 。1997年，山东省的养殖牙鲆 发生 r淋巴囊肿病 (1ymphocystisdisease，LD)，这是该病在我 国养殖牙鲆 中的初次大规模暴 发I1]。病鱼鳍、鳃及体表出现乳头瘤样 的赘生物，严重影响其市场价值，造成重大的经济损失。 因此，分离培养该病毒，为下一步进行疫苗的研制，预防淋 巴囊肿病 的发生就显得极为重要 。 国外 已有利用培养细胞研究淋巴囊肿病毒等虹彩病毒的报道 2【]，但利用牙鲆细胞培养分 离淋巴囊肿病毒国内外 尚未见报道 。本文利用本实验室建立的牙鲆鳃细胞系(floundergill cellline，FG)对淋 巴囊肿病毒进行了分离及培养，并对该病毒 中国分离株在牙鲆培养细胞 中 的形态及感染过程进行了探讨 。 1 材料与方法 1．1实验材料及试剂 (1)患淋巴囊肿病的牙鲆(1eft—eyedflounder，Paralichthyolivaceus)于2002年4月取 自威海 华能电厂养殖场 。患病牙鲆的口唇部、躯干皮肤、鳍及尾部可见单个或成群的鱼卵状或水泡状 肿胀物，尤其在背鳍、尾鳍处较多。大小不一，大的有如枣或核桃大 。 (2)牙鲆细胞系FG本实验室于 1993年建立 。 (3)培养基 Eagle’sMEM 及小牛血清购 自Hyclone． 国家高技术研究发展 (863)fl-~lJ项 目(2001AA628020及 2001AA62203o)．山东省自然科学基金 (Y2001D10)、高等学 校骨 f教师资助计划项 目和国家 自然科学基金 联合资助 收楠 I{期：2002—07—17；修订 日期 2003一O1—10 吕宏旭 ．男．1980年 12月出生，硕士生 。 * 通讯‘联 系人 维普资讯 青 岛 海 洋 大 学 学 报 1．2实验方法 1．2．1细胞培养和病毒分离 1．2．1．1病毒无菌滤液的制备 分别取病鱼的囊肿组织置于研钵中，加入 4倍体积的MEM 培养基作为缓冲液。匀浆后，吸入离心管中。4C，2O00r／min离心 30min。在超净台中取上清 液 ，用针式过滤器 (0．45t~m)过滤 ，分装入 1．5mI灭菌离心管 中，备用。 1．2．1．2琳巴囊肿病毒的分离和培养 正常FG细胞在传代时，即 1瓶细胞传为 2瓶后，加 入 0．1mI病毒除菌滤液 (25cm 培养瓶)，轻轻摇匀，22C培养箱中培养。此后，细胞每隔7d传 代培养 1次，每次传代时均加入 0．1mI病毒悬液 。 1．2．2电镜检测 1．2．2．1淋 巴囊肿组织超薄切片的制备和 电镜观察 取新鲜囊肿组织，加入 2．5 (V／V) 的戊二醛快速固定