一种基于温敏质粒的新型基因敲除方法_姜娜.pdfVIP

China B iotechnology, 2010, 30( 3): 85-89 1, 2 2 1 1* 2* 姜 娜 王艳春 马志宏 罗 琳 刘纯杰 ( 1 100068 2 100071) 基于温敏型质粒而不用线性 DNA 的方法用于快速敲除沙门氏菌染色体上的目的基因以 伤 沙门氏菌S. ty2 基因组为模板扩增得到的 ssaV 基因的上下游同源臂, 与两端带有 RT 位点 的卡那霉素抗性基因片段连接到温敏型质粒 pHY304, 共同构建同源重组载体; 然后转化 S. ty2, 通过筛选得到带有抗性标记的重组菌通过转入重组酶表达质粒 pCP20, 去除抗性标记, 得到 ssaV基因缺失的重组菌, 并在 DNA 水平进行了鉴定建立了一种改进的基于温敏质粒的沙门氏 菌的基因敲除方法, 此方法也值得在其他革兰氏阴性菌的基因敲除中尝试应用 伤 沙门氏菌 温敏质粒 KR ed重组系统 ssaV 基因敲除 Q75 KRed 1 DNA, 1. 1 Red K (Salmonella typ hi, S. typhi) S. ty2 , exobet gam L- ; , L- (E scherichia coli, E. coli) DH 5ATop10 , DNA DNA ; pKD46pCP20 pHY304 , ; pET22b-kana [1-3] pKD46 Red ;T4 L-, ; Pfu T aq [4-5] ; , DNA Prom ega; L- Sigm a , , 1. 2 1 , ssaV 1 , ( type III Table 1 Prim ers and sequence characteristics secretion system, TTSS ) ( Salmonella Prmi er nam e Prmi er sequence( 5c-3c) Restriction sites p athogenicity island, SPI2) , , ussaVf CGCGGATCCTCCATCGCATTCATT B amHÑ [ 6] ussaVr CGCGTCGACCCGGAAAAAGATAGTAT SaÑl TTSS dssaVf TTGCGGCCGCACTCCAGAAATTTTAT N oÑt DNA dssaVr CCGCTCGAGATACCCGATAACTGTT XhoÑ kssa