噬菌体-指示菌模型体外评价抗病毒药物的初步研究.pdfVIP

噬菌体－指示菌模型体外评价抗病毒药物的 初步研究 杨智勇，李铁民，张蕊，张博，胡永飞，李玉 辽宁大学生命科学院，辽宁沈阳 (110036) E-mail：zhiyongyang1982@ 摘 要：目的：应用噬菌体-指示菌模型体外评价抗病毒药物。方法：用M13 噬菌体和大肠 杆菌建立噬菌体-指示菌模型，体外分别测定双黄连、病毒唑和甘草酸单胺对大肠杆菌的抑 制作用，对噬菌体的抑制作用和药物抑制噬菌体的时间动力学曲线。结果：甘草酸单胺对大 -8 肠杆菌未显示抑制作用，而双黄连和病毒唑的浓度分别低于 10 mg/ml 时，对大肠杆菌不具 抑制作用。双黄连和病毒唑对噬菌体均具有抑制作用，双黄连和病毒唑分别与噬菌体作用 20 h 后的抑制活性最强，抑制率分别为89.69 %和47.50 % 。而甘草酸单胺对噬菌体不具有 抑制作用，结论：噬菌体－指示菌模型可用于体外评价抗病毒药物，而且，具有安全、快速、 简便易行的特点，适于从大量天然产物中初筛抗病毒药物。 关键词：噬菌体-指示菌模型，抗病毒，药物筛选 1．引言 病毒性疾病严重威胁人类健康，筛选抗病毒药物已成为新药研发的一个热点，然而，采 用何种方法评价抗病毒药物是抗病毒药物研究的关键技术之一。近年来，人们应用生物模型 及药物作用靶标对抗病毒药物进行筛选[1]，这些方法和技术在抗病毒药物筛选中得到了一定 的应用。通常采用的体外评价药物抗病毒活性的方法主要是基于病毒在培养细胞中复制的能 力，有些病毒可导致细胞致病作用或形成空斑，有些病毒能产生特异的功能或细胞转化。所 以，体外抗病毒试验通常采用抑制病毒致病力、抑制空斑形成降低及病毒量减少或功能降低 [2] 等方法 。 噬菌体为细菌病毒，裂解细胞具有特异性，感染细胞方式和增殖方式与动物病毒相似， 而且，近年的研究表明，噬菌体在核酸组成、蛋白外壳等方面与真核生物病毒相似[3] 。基于 噬菌体与动物病毒相似的诸多特性，为了建立一种方便快捷、敏感、客观和准确的体外筛选 和评价抗病毒药物的方法，本文对噬菌体-指示菌模型用于体外评价抗病毒药物病毒唑、双 黄连和甘草酸单胺进行了初步研究。 2. 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 培养基 固体，半固体和液体培养基均为LB 培养基。 2.1.2 噬菌体和细菌 M13 噬菌体，购自中科院武汉病毒研究所；大肠杆菌 BL21 作为指示菌，本实验室保存。 2.1.3 药物 双黄连胶囊，浙江巨都药业集团有限公司产品；病毒唑（利巴韦林注射液），济南黎民 制药有限责任公司产品；甘草酸单胺，新疆天山制药有限公司产品。 -1- 2.2 方法 2.2.1 药物配制 双黄连溶液：称取一定量双黄连胶囊内容物，充分溶于蒸馏水中，滤膜除菌后备用。 病毒唑原液浓度为 100mg/ml 。根据需要用蒸馏水稀释，滤膜除菌后备用。 甘草酸单胺溶液：称取一定量的甘草酸单胺，充分溶于蒸馏水中，滤膜除菌后备用。 2.2.2 噬菌体制备 在培养至对数期的大肠杆菌菌液中加入一定量的噬菌体，37℃摇床培养 24 h ，10000 rpm 离心 5 min，硝酸纤维膜过滤后得到噬菌体。 2.2.3 噬菌体效价测定 [4] 噬菌体效价测定采用双层平板法 。 2.2.4 药物对指示菌抑制作用测定 用无菌水分别将双黄连、病毒唑和甘草酸单胺溶液依次稀释至不同浓度，分别取不同稀 释度的药液 0.9 ml 与 0.1 ml 过夜培养的大肠杆菌悬液混合，以不加药液的大肠杆菌悬液为 对照，置 37℃孵育 24 h 后，分别取 0.1 ml 涂平板，计数菌落数。 2.2.5 药物对噬菌体抑制作用测定 用无菌水分别将双黄连