突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗的构建表达和免疫效果研究.pdfVIP

突变型乙肝病毒前C—C基因疫苗的构建表达及 免疫效果研究 张敏 g--壹gA胡燕 候俊 沈宏辉 王志杰 孔维 藐盼勇 解放军第302医院 北京100039 并通过动物试验研究突变型前C—C基因疫苗的免疫效果。方法采用单引物二次PCR法对质粒VEC依次 细胞并免疫Balb／c／J、鼠。通过细胞免疫化学、酶联免疫分析、免疫印迹、酶免疫斑点、细胞杀伤试验等 方法检测其在HepG2_tN胞内的表达和诱导小鼠特异性体液、细胞免疫的情况。同时联合小鼠叫干扰素基 1后特异性细胞免疫增强。结论 突变型前C．C基因疫苗可在真核细胞表达目的蛋白且免疫效果优于突 变前。1干扰素基因可作为基因佐剂增强HBVDNA疫苗诱导的特异性细胞免疫反应。 【主题词】 乙型肝炎，DNA疫苗，点突变，Pre—C抗原，增强子Ⅱ 由=J=DNA疫苗在诱导机体特异性细胞免疫方面具有独特优势，已作为针对慢性乙肝具有潜力的免 疫治疗手段被广泛研究。目前乙肝HBVDNA疫苗研究的焦点在于如何诱导足够强的特异性细胞免疫， 以达到治疗目的。本室前期研究已将乙肝增强子Ⅱ(EHN 1I)廊C—C基因插人vRl012载体，构建出重 组乙肝DNA疫苗VEC，且实验证实能引发针对病毒核心蛋白的特异性细胞免疫反应[1]。因有研究表明成 析、免疫印迹检验目的蛋白真核表达情况。最后免疫Balb／c／]、鼠，用酶免疫斑点、细胞杀伤试验等方法 免疫，了解有无增强免疫的作用。 1．材料与方法 1．1材料- 通讯作者：貌盼勇 一932— 为真核细胞表达载体VRl012插入乙肝病毒增强子II(EHC 1I)及前C—C基因序列，全长4913bp，含卡那 1I 霉素抗性基因、CMV(E细胞病毒)启动子及原核细胞高拷贝因子等其他常规部件；插入序列ENH l、154、164、167位氨基 酸残基变异为甘氨酸。共设计合成4对引物，突变点位于引物中心。由赛百盛公司合成。 1．1．2菌株、细胞、试剂及实验器材：感受态DH5d菌、卡那霉素、转化试剂A购自北京博大泰克 Kb 剂盒、DNAMarker(1 试剂盒购自北京科卫试剂厂，梭华转染试剂购自北京天来公司，兔多克隆抗HBc购自北京中杉金桥生 物公司，DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物公司，鼠单克隆抗HBc购自美国Santacruze公司，ECL 化学发光检测试剂盒购自Pierce公司， 自上海华美生物公司，酶标仪为芬兰Labsystems公司产品，MJMiniPCR扩增仪为美国BIO—RAD公司产 品，ELISpot酶联斑点分析仪为北京赛智创业公司产品。 MHC Ⅱ类抗原表位HBcAg(AAl31—139)AYRPPNAPI， I类抗原表位HBcAg (AA8 1-96)SRELVVSYVNVNMGL。 1．1．4实验动物Balb／cd、鼠购自军事医学科学院，雌性，6～8周龄，18～25克，SPF级。 1．2方法 7端引物151正、Pfu酶 1．2．1质粒VEC点突变的完成以VEC质粒2斗l(200ng)为模板，加入5 粒测序。如上述步骤在突变质粒的基础上再依次实现另外3个核酸位点突变，分别变异151、154质粒 (VEC2)，变异15l、154、164质粒(v VEC4大量提取质粒备用。 空载体免疫对照组；m1+VEC、rfl 组的检测数据。 I．2．3真核细胞表达目的抗原检测 sofast 严格按