梨脱水蛋白PpDhn基因的克隆和其在果实货架期间表达研究.pdfVIP

梨脱水蛋白PpDhn基因的克隆及其在果实货架期间表达研究 镇2。 李晓刚1’2，蔺 经1，常有宏1，丛郁1，章 (1江苏省农科院园艺研究所南京210014；2南京农业火学园艺=学院南京210014) 的序列特性进行了分析，PpDhn基因含有1个保守的Y结构域和3个K片段。在梨果实货架期问表达分析 表明，低温下表达量迅速上升，而l—MCP、涂蜡和室温处理则随失水加重而缓慢上升，达到一个峰值 迅速下降。 关键词：梨；脱水蛋白：基因；RT-PCR abundant 脱水蛋白属于LEA(1ateembryogenesisprotein)II蛋白家族，许多研究者认为脱水蛋白的 积累与植物细胞抗脱水力的形成有密切关系Ill。脱水蛋白最初在种子中发现，随后的研究表明脱水蛋白 广泛存在于细菌、藻类和高等植物的各个组织和器官中【21，干早、低温和高盐等引起脱水的环境以及 ABA均能诱导其在绿色组织中的表达131，推测脱水蛋白在植物受到干旱失水时，能够部分替代水分子， 保持细胞液处于溶解状态，从而避免细胞结构的塌陷，稳定细胞结构，尤其是膜结构，起分子伴侣和 亲水性溶质的作用，在水分胁迫时稳定和保护蛋白质的结构及功能【4J。 梨是世界三大水果之一，其生长和产鼍都受剑干旱、低温和高盐等环境胁迫的严重影响。到目前 为止，还没有关于梨脱水蛋白类基因的报道。脱水蛋白在植物抗逆中作J}J明显11．5’6J，而提高梨对这些环 境胁迫的抗性在生产中义非常重要。此外，果实火水，影响砂梨货架期的首要冈素，如果降低梨果失 水率一直是研究者普遍关心的问题。本研究试图从梨中克隆脱水蛋白基因，并研究其在梨果货架期间 表达规律，为梨抗逆生产及提高贮藏性提供候选基闪。 1材料与方法 1．1材料与处理 基因提取用翠冠梨组培苗，低温4℃处理12d时。货架期间表达选刚翠冠梨成熟果实，分别设1一 末形式，由美国罗门哈斯公司提供，处理参照颜志梅的方法【6l。涂蜡剂采川国家农产品保鲜J：程技术研 究中心研制的大彩果蜡。 1．2引物设计与合成 根据GenBank登录的苹果和桃等家族成员氨基酸和核前酸保守区序列，设计合成两条简并引物。依 据保守区序列发计3’和5’扩增特异序列，依据拼接的全长序列没计开放阅读框表达序列。 表l设计引物序列 1．3总RNA的提取及PCR扩增 于PGEM—T Easy载体上，转化感受态大肠杆菌，经蓝白斑筛选及酶切验证鉴定同l性克隆。上海生工生 收稿日期：2009-04．30 +通讯作者Authorfor correspondence(E-mail：zhangzh@nj龇．edu．cn) 行多序列比对分析。 1．4基因在梨果实货架期问表达 邋梨果实不同时间果肉eDNA为模板进行RT-PCR。2％琼脂糖凝胶电泳检测，并进行半定量计算。不 同处理下基冈表达量以各目的基冈条带?仁定量计算的量表示。 2结果与分析 2．1PpDhn保守区基因片段的克隆 拉，转化感受态细胞后获得重组质粒，进一步测序结果得到了一条401bp人小，编码109个氨基酸的eDNA 片段。将该序列的核前酸和氨基酸序列分别在NcBl服务上的Blast软件中进行检索，初步推定它为梨脱 水蛋白成员的保守区序列。 2．2PpDhn编码基因的克隆 扩增得剑了一个280大小的eDNA片段，序列测定结果表明其为PpDhn的5’端上游编码区序列。 序列，编码184个氨基酸，推测的分子量为19．47KD，Pl(等电点)为5．28。 2．3PpDhn序列分析 脱水蛋白一般含有Y、S、K保守序列【7】’本序列具有脱水蛋白Y和K的典型特征。在N端，有一个 段，只是保守性不强。 l M h N Y Q T K Y 61 G T T P Q D I D E Y G N P I Q Q G T T G 121 G L G G A T T G T A Y G A T G G Q Q Q Q 181 E R G T G M T G S G Y G T T D A P Y T G