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中国狂犬病毒遗传多样性研究 孟胜利1，徐葛林1，程满荣1，吴杰1，雷勇良2，朱风才3， 周敦金‘．王定明5，杨晓明1．严家新1 (1武汉生物制品研究所．武汉430060；2丽水市疾病预防控制中心，浙江丽水323000 3江苏省疾病控制中心，南京 210009；4武汉市疾精控制中·心，武汉430022； 5贵州省疾病预防控制中心传染病防治所，贵阳550004) 摘要：在1969—2(308年间，我们从全国各地共分离到60株街毒株，其中从犬脑中分离到41株，鼬瑾中分离5株， 人脑中分离到4株，鹿脑中I株，我们对这61株狂犬病毒株的N基因的进行了序列测定，初步分析后选取26株代 表株与GenBank得到42株中国毒株N基因序列共计68株序列进行全面的进化分析．以探讨中国狂犬病毒株的基 因分型和分组情况、时问和空间的动态进化。结果表明：我们发现目前分离的中国毒椿都属于基因1型狂犬病毒， 可以分为2个大的进化分支共计8个组，分支I包括1-4组．分支Ⅱ包括5-8组，组内植苷酸同源性≥93．2％，氨基 酸同源性94．3％；组间棱苷酸差异性至少是80％，氨基酸差异至少是i，7％；选择压力分析表明中国狂犬病毒处 于较强的净化选择约束下，狂犬病毒N蛋白中的核苷酸突变主要是同义突变；运用贝叶斯中的马尔科夫链的蒙特 卡洛方法估计中国狂犬病毒N基因核苷酸的平均碱基替代率为1,1089×104取代／位点／年，共同祖先出现在公元 1040年前；同一毒株或者核苷酸同源性很高的毒株在不同地点、不同宿主中出现表明中国狂犬病毒株存在跨地域、 跨宿主传播；我国狂犬病高发区流行的毒株(分支I)与泰国、越南、菲律宾、印度尼西亚、马来西亚等东南亚国家分 离的狂犬病毒株同属于一个进化分支；分支Ⅱ的毒株在全球分布。 关键词：狂犬病毒；分子流行病；N基因；中国 狂犬病毒的N基因全长1424个碱基，开放读RABV蛋白总含量的36％…1。 码框为1353个碱基，共编码长为450个氨基酸的核 由于RABVN基因的保守性，因此除了用于常 蛋白N。核蛋白是RABV中最稳定的蛋白，在病毒规检测的靶点以外，通常可用于RABV的基因分 的转录复制过程中与基因组RNA紧密结合成核糖 型、用于分析RABV的地域特性、病毒来源、宿主转 核蛋白复合体(RNP)，保护病毒RNA免遭核酸酶的换等时空进化…-761。 破坏，并对病毒的转录与复制进行调节惮瑚J。N蛋 本研究共对中国61株中国RABV街毒株进行 白是RABV主要保护性抗原之一，能刺激机体产生 N基因 了N基因完整基因测序，通过对中国RABV 细胞免疫，产生的免疫应答可抑制病毒在细胞间的 序列的分析，分析我国RABV的分组情况、共同祖 传播和细胞内复制m．“。N基因的高度保守．尽管 先的起源时间、对其进化的时空动态进行分析预测， 在RABV不同基因型间N蛋白有个别区段氨基酸旨在为我国狂犬病的预防工作提供理论依据。 序列变异较大．但N蛋白是RABV5个结构蛋白中 材料和方法 最保守的蛋白；不同RABVN蛋白序列存在较高的 丽源性和高度一致的抗原性，因此N蛋白常被用于 1实验试剂及材料 RABV的基因分型、诊断和流行病学调查““越引。 分子生物学试剂见实验一。RABV的组织样品 病毒的核苷酸序列在选择压力下可能发生的密 材料采自湖北、江苏、安徽、河南、广西、贵州等省，共 码子同义突变．基于核苷酸序列水平的基因分型方 60株街毒株．1株疫苗株，见表1。 法比基于蛋白质抗原水平的血清分型更为敏感、准 2病毒RNA的提取及RT．PCR扩增 确，而RABV的基因组在转录过程中存在的衰减现 RABV按蛋白基因序列所用引物由大连上海捷 象，转录效应由3’到5’端递减，相对而言N基因的 瑞公司合成，引物序列、位置见表2。RT—PCR方法 拷贝数及其编码蛋白在RABV中的含量都是5个结参见试验一。 构基因中最高的，通常达到1800