DNA的粗提与鉴定.pptVIP

DNA的粗提与鉴定 四个标准 所得DNA的纯度应满足下游操作的要求； 所得DNA应当完整； 所得DNA应有足够的量； 如果是对植物进行大规模的筛选，还应当满足操作程序快速，简单，价格低廉，并尽量避免使用有毒试剂。 一、实验目的 掌握DNA提取技术操作原理 培养分子生物学实验操作能力和观察能力。 二、实验原理 通过去污剂破碎细胞膜，释放出基因组DNA，利用DNA不溶于乙醇的特点从细胞粗提液沉淀出DNA分子。最后通过核酸特异染料二苯胺进行鉴定。 实验材料：新鲜菜花 药品： DNA提取液（1000 ml）： 秤取Tris 10.1 g，先加入50 ml蒸馏水溶解，然后用浓HCl调pH至8.0，再加入NaCl 8.76 g，EDTA 37.2 g， SDS 20 g，待药品全部溶解后定容至1000 ml。 二苯胺试剂的配置： 称取1.5克二苯胺，溶于100mL冰醋酸中，再加1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存。临用前，在10mL的上述溶液中再加入0.1mL体积分数为0.2%的乙醛溶液。 药品在DNA提取中的作用 NaCl: 高盐去除糖类，中和DNA侧链的磷酸根离子的负电荷，以减少DNA分子之间的排斥，便于沉淀。 Tris(三羟基氨基甲烷) ：和HCl一起构成缓冲对，能维持提取溶液pH 环境。 EDTA（四乙酸乙二胺二钠）： 螯合剂，能螯合DNA 酶活性所需的Mg2+,防止DNA被DNA 酶降解。 SDS（十二烷基硫酸钠）：去污剂，破坏细胞膜，变性蛋白，抑制DNA 酶活性。 二苯胺：核酸特异染料 四、实验步骤： 取5g菜花顶花部分放入研磨过滤器中，加入 5 ml DNA提取液，充分研磨。 将研磨液转移置10 ml离心管中， 65℃保温10 min。 6000rpm离心10min。 取上清液至另一个10 ml离心管中。 加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），混匀。12000rpm离心10min。小心吸取上清液至另一个10ml离心管中。 加入2倍体积的 100%乙醇，混匀，会看到白色絮状沉淀，可用玻璃棒挑，此为粗提植物基因组DNA。 弃去乙醇，吹干沉淀后溶于1ml灭菌重蒸水中。 二苯胺鉴定：在上述DNA溶液中加入1ml二苯胺试剂，混匀。在另一只管中加1ml灭菌重蒸水和1ml二苯胺试剂，混匀，作为不含DNA对照。将两管在沸水浴中煮10 min,在加热过程中随时观察溶液颜色变化。 移液器的使用说明 使用方法： 　　使用时将移液器刻度调整到需要量取的数值上，安上相配套的吸头；将取液按钮按到一档后（感觉有明显阻力）将吸头插入需量取的液体中，缓缓松开按钮，液体即被吸入吸头内；缓缓将按钮按到一档将吸头内液体排入所需容器，2－3秒后将按钮按到二档后（不可以再往下按）将残留液体排出即完成取液，使用后使用褪管按钮将吸头放到废物杯中。 注意事项： 使用时不可猛吸猛排，以防溶液进入管腔内，影响密闭并造成污染。 管内吸有液体时禁止将移液器平放，以防液体进入管腔内。 刻度调节不可超过刻度范围，以防卡死。 二苯胺鉴定DNA 用琼脂糖凝胶电泳（0.8%）检测核DNA的完整性 紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度 用紫外分光光度计在230nm、260nm、 280nm和310nm波长分别读数。其中260nm读数用来估计样品中DNA的浓度，OD260/OD280与OD260/OD230的值用于估计DNA的纯度，310nm为背景吸收值。1个OD260值相当于50μg/mL双链DNA。 样品浓度（μg/mL）=（OD260- OD310）×稀释倍数×50 对于DNA纯制品，其OD260/OD280≈ 1.8，OD260/OD230应大于2。OD260/OD280 1.8 说明有RNA污染；OD260/OD2801.8说明有蛋白污染。 * * 微量可调移液器是一种在一定范围内可连续调节的移液器，主要用于少量液体的定量量取。