cDNA文库构建方法的研究进展.pdfVIP

·40· 生物技术 中国畜牧兽医 2012年第39卷第7期 cDNA文库构建方法的研究进展 刘太峰1’3，孟庆峰4，段小波2。董浩1 (1．吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118；2．吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118； 3．吉林农业工程职业技术学院，吉林四平136001t4．吉林出入境检验检疫局。吉林长春130062) 摘要：eDNA文库的构建是一种重要的基因克隆的手段，主要用于新基因的发现及基因功能的研究。作者主要介绍cD- NA文库的构建方法及eDNA文库的一些实际应用，为研究cDNA文库的构建提供一些有价值参考意见。 关键词：eDNA文库；构建；研究进展 中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1871—7236(2012)07—0040—03 eDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为 mRNA为模板，反转录成eDNA第一链，通过自身 模板，逆转录形成的互补DNA与适当的载体(常用 噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌形成重组 等，2003)。用过柱子或其他方法去除小分子ds DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA，对留下来较大的dseDNA切平端，接上接 cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库 头，磷酸化后克隆到载体中，在细菌中大量繁殖，这 (萨姆布鲁克等，2002)。从20世纪70年代开始，由样每个克隆中都保存有一段该细胞的eDNA。但是 于限制性内切酶的发现及质粒等载体的应用推动了 经典eDNA文库中低丰度表达的序列出现的几率 DNA体外重组技术的发展，eDNA文库的构建是基很低，需要的mRNA量也很大，同时筛选eDNA文 因克隆的重要方法之一，从cDNA文库中能够筛选库的工作量也很大，程序很繁琐。随着分子生物学 到所需要的目的基因，并直接用于该目的基因的表 的快速发展，cDNA文库的构建方法有了很大的进 达，是发现新基因和研究基因功能的基础工具 步(Mahon等。2001)。 (Kkuehi等，2003)。第一个cDNA文库由Hofstet—2差示cDNA文库 ter于1976年构建的，由于刚开始构建的eDNA文差示cDNA文库是反映不同组织和细胞或同 库存在着合成效率低。难以扩增等缺点，许多科研工 一细胞在不同功能状态下，基因表达出现差异的 作者经过不断的努力将文库的构建方法进一步完善 和高效(Seki等，2002)。目前cDNA文库的种类主胞，也可以是同一细胞不同状态的mRNA，将一种 要包括经典eDNA文库、标准eDNA文库、差示 eDNA文库、酵母双杂交文库、mRNA差异显示文 细胞过量的mRNA进行杂交，若第一种细胞中存 库、限制性cDNA文库等(李海红等，2003)。eDNA在不同于第二种细胞的特殊基因，那么第一种细胞 文库构建的一般程序是组织或细胞总RNA的提 的eDNA不能与第二种细胞的eDNA形成杂合双 取，mRNA的富集，cDNA第一链的合成，eDNA第链，分离未形成杂交体的eDNA，以此为模板合成 二链的合成和纯化，接头或连接子与cDNA的链 接，转人受体菌，eDNA文库的克隆及鉴定(朱利军就是差示eDNA文库(Suzuki等，2001)。 3 mRNA差异显示文库 等，2009)。作者主要介绍cDNA文库构建的几种 主要方法及其常规的应用。 mRNA差异显示文库是根据mRNA差异显示 l 经典cDNA文库 技术构建的eDNA文库。其构建程序是用细胞的 A+ 总RNA或mRNA为模板，合成上、下游引物。5’ 经典cDNA文库是以细胞或组织的poly 端引物含有Hindm内切酶位点，引物由13个碱基 收稿日期：2