PAR4在初级感觉神经元与表达及对TRPV1调控机制与研究.pdfVIP

PAR4在初级感觉神经元的表达及对TI冲V1调控机制的研究 研究生：陈丹 专业：人体解剖与组织胚胎学 导师：王昭金教授 中文摘要 目的 蛋白酶活化受体4(PAR4)为G蛋白偶联受体，参与多种病理生理的过程。最 近研究发现PAR4在外周炎症和疼痛调节中具有重要作用。以培养的大鼠背根神经节 受体及其活化的细胞内机制，以及与伤害性感觉受体瞬时电位香草酸受体亚型1 (TRPVl)之间的相互关系，从而为进一步阐明PAR4参与外周痛信号的调节作用提 供实验依据。 方法 1．以急性分离、培养大鼠的DRG感觉神经元为研究模型，利用免疫荧光的方法 结合激光共聚焦显微镜技术，研究PAR4和TRPVl在体外培养的大鼠DRG感觉神经 元的表达以及两者的共存。 PAR4表达和PAR4介导TRPVl基因表达的调节作用。 白表达的调节作用。 结果 1．DRG感觉神经元的分离与培养： 吹打，制成细胞悬液，种置于六孔培养板观察不同时间段细胞的数量，大小以及突起 的长度。接种于六孔培养板的神经细胞培养4小时作用，倒置显微镜下观察，可见部 分神经细胞已贴壁，贴壁的神经细胞为圆形或椭圆形，胞体周围有一圈光晕，尚无突 1 起。神经元的细胞核位于细胞中央或胞体一侧，核仁明显。接种24小时后，大部分 细胞已贴壁，贴壁细胞长出小突起，除单个散布的神经细胞外，常可见几个或多个神 经细胞聚在一起，它们向四周发出树枝状突起。培养3．4天的神经细胞的突起逐渐延 长增粗，可看到神经细胞的突触交织在一起形成稀疏的网状结构。随着培养时间的延 长，神经细胞突起的主干和分枝都明显延长并增粗，神经细胞突起形成的网络结构变 得更加稠密，神经细胞胞体逐渐增大。随着培养时间的延长，细胞数量会减少。 2．PAR4在DRG神经元的表达： 免疫荧光组织化学结合激光共聚焦结果显示，在体外培养的大鼠DRG神经细胞， 可见大量的感觉神经元表达PAR4，PAR4阳性神经元数量和形态变化与上述体外培 养的DRG神经元类似。培养1天的阳性细胞多为一些中小神经元，直径为11—28微 米，也偶可见一些大型神经元表达PAR4，形态呈圆形或椭圆形。培养24小时后，PAR4 阳性神经元生长突起出现，培养3．4天DRG神经元可出现PAR4阳性轴突。阳性标 记物主要出现在细胞膜、细胞浆，细胞核未见表达。 3．PAR4与TRPVl在DRG初级感觉神经元共存： 细胞相似，可见大量的中、小型TRPVl阳性神经元胞体，形态呈圆形或卵圆形。TI冲V1 的阳性物分布于细胞膜、细胞浆，细胞核未见标记。DRG培养24小时后，可见TRPVl 阳性的树突和轴突。荧光双标结合激光共聚焦结果显示：体外培养的DRG神经元均 65．3％土3．2％f1 4．AYPGKF—NH2对PAR4在初级感觉神经元表达的影响及细胞内机制 blot结果 较有统计学意义∽D．∞，)。瓯PCR结果显示：加R姝4激动剂组与空白对照组相比 (Po．05)， 1“M) 和抑制剂(PHⅪ14—22 激动剂孵育1小时，W．estem 激动剂组相比都使PAR4蛋白表达量减少，但加PKA激动剂组的渊蛋白的表达 达量增加1．17倍。加入PKA抑制剂组和空白对照组比较均有统计学意义伊n∞／)。 5．PAR4对初级感觉神经元TRPvl表达的影响及细胞内机制： 入培养的神经细胞内作用1小时，westem 学意义伊n晒夕。 结论 TI冲Vl共存。 抑制剂可增强AYPGl江-NH2对P』州蛋白和mI斟A表达的调控和作用。 制剂可抑制AYPGKF．NH2对T砌V1蛋白和mRNA表达的调控和作用。 关键词蛋白酶活化受体4；疼痛；瞬时受体电位香草酸亚型1；背根神经节；感觉神 经元 NEURONS INPRIMARYSENSORY