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普鲁兰多糖的分离纯化及结构鉴定 作者：曹海石 添加日期：2011-08-20 23:21:02 浏览：270次 普鲁兰多糖是由茁芽短梗霉(A u reobasid ium p u llu lans) 分泌的胞外多糖[ 1 ] , 它具有无毒害、粘结性强和成膜性好等优良特性, 可作为食品、医药方面的粘合剂和包装材料. 此外, 也广泛应用于水果蔬菜保鲜、种子保护、化妆品和卷烟生产等方面, 是一种新型的多功能生物产品, 有较好的应用前景[ 2, 3 ]. 目前, 普鲁兰多糖的应用国外已申请了多项专利, 我们实验室经紫外诱变筛选出一株高产普鲁兰多糖的菌株(A u reobasid ium p u llu lans JB518) [ 4 ] , 对其产生的多糖进行了分离纯化, 该纯化方法简便、回收率高. 同时通过薄层层析、红外光谱及核磁共振等方法对其结构进行了鉴定, 证实了它的基本结构单位为麦芽三糖, 每个麦芽三糖之间由A(1→6) 糖苷键相连, 这为该变异菌株的应用提供了理论依据. DEA E2纤维素为W hatm an 产品, Sephadex G2100 为Pharm acia 产品, 普鲁兰多糖 (Pu llu lan) 标准品、 麦芽三糖和普鲁兰酶(EC. 3. 2. 1. 41) 为Sigm a 产品, 其它化学试剂均为国德国B ruker 1FS66V 真空型红外光谱仪. 美国V arian 公司U n ity 400 NMR 仪. 将本实验室经紫外诱变获得的茁芽短梗霉(JB518) , 在含2% 蔗糖, 012% 的酵母浸膏, 012% KH2PO 4, 0. 1%MgSO 4?7H2O , 0. 1%NaOH 和0. 04% (NH4)2 SO4 的液体培养基中培养, 在250 mL 锥形瓶中加入50 mL 培养基, 用接种环移菌3 次, 于28 ℃发酵96 h, 发酵液in 的转速下离心30 m in, 去沉淀, 上清液加入2 倍无水乙醇, 搅拌、放置过夜,使普鲁兰多糖充分沉淀. 沉淀液以4 500 r/min 离心30 min, 得普鲁兰多糖沉淀, 沉淀依次用丙酮、乙醚洗涤, P1O5干燥, 即得普鲁兰多糖粗品, 从50 mL 发酵液中可得其粗品115 g.1. 3　多糖及蛋白质含量的测定 采用改良的苯酚2硫酸法[ 5 ]. 取待测溶液012 mL , 加入浓度为50 g?L 的苯酚溶液014mL , 混合均匀后迅速加入2 mL 浓H2SO 4, 振荡摇匀, 于室温放置30 m in, 用721 分光光度计在490 nm 处测定光吸收值.采用Low ry 法[ 6 ] , 以牛血清白蛋白为标准蛋白测定蛋白质含量.1. 4　核磁共振光谱测定及薄层层析1H NMR 频率399195MHz, 90 ℃脉冲25 Ls, 脉冲延迟时间316 s, 累加128 次, 溶剂DM SO 2d6, 参考标准: DDM SO = 2150, 样品浓度5% (质量体积分数) , 控温误差±0. 1 ℃.13C NMR 频率100157MHz, 90 ℃脉冲14 Ls, 脉冲间隔115 Ls, 宽带噪音去偶, 累加3 000次, 溶剂DM SO 2d6, 参考标准: DDM SO = 39160, 样品质量体积分数12% , 控温误差±0. 1 ℃.薄层层析(TLC) 采用硅胶板法[ 7 ]. 在10 g 硅胶G260 干粉中加入0102mo l?L 的乙酸钠溶液25 mL , 搅拌均匀, 平铺在玻璃板上, 自然晾干后, 于120 ℃加热活化30 m in, 制成硅胶板.1. 5　刚果红实验Fig. 1　Curve eluted on DEAE-cellulosecolumn by waterFig. 2　Curve eluted on DEAE-cellulosecolumn by Na2B4O7 solution参照文献[ 8 ]方法. 刚果红溶液浓度为215×10- 5 mo l?L , 普鲁兰多糖溶液质量浓度为10 m g?mL. 将N aOH 依次配成不同浓度(012～ 110 mo l?L ) , 将普鲁兰多糖溶液和刚果红溶液混合(体积比1∶1) , 然后加入与混合液等体积的不同浓度的N aOH, 静置15 m in 后, 用721 分光光度计依次测定混合液在不同浓度的N aOH 溶液中最大吸收波长的变化(以刚果红溶液为对照).2　结果与讨论2. 1　普鲁兰多糖的纯化2. 1. 1　Savage 法　参照文献[9 ]方法. 将610 g 普鲁兰多糖粗品稀释成115% 的水溶液400mL , 加入100 mL 氯仿?丁醇混合液(体积比4∶1) ,