pB2 R-Venus 重组真核载体的构建及在 HEK293T细胞中的表达.pdfVIP

济宁医学院学报 2014年 1o月第 37卷第 5期 3O9 doi：10．3969／j．issn．1000—9760．2014．05．002 · 基础医学 · pB2R—Venus重组真核载体的构建 及在 HEK293T细胞中的表达 季丙元 程葆华 王春梅 陈 京 白 渡地 (1济宁医学院神经生物学研究所，山东 济宁 272067；。山东农业大学生命科学学院，山东 泰安 272018) 摘 要 目的 构建带有黄色荧光蛋 白突变体 Venus标签 的人缓激肽 2型受体 (bradykininreceptor2， B2R)真核表达载体 ，用于 B2R与相关受体及蛋 白的相互作用、B2R受体介导的信号转导机制的研究等。方法 根据人B2R基因序列设计引物，以质粒 pcDNA3．卜B2R为模板，PCR扩增 目的基 因人B2R。EcoRI和 BamH I双酶切扩增产物及质粒 pVenus—N1，经 回收、连接 、转化，获取重组质粒 。对重组质粒进行酶切 、测序鉴定。转 染重组质粒至 HEK293T细胞 ，荧光显微镜观察受体 B2R 的细胞定位 ，蛋 白印迹法检测 目的蛋 白人 B2R蛋 白的 表达 。结果 PCR扩增 出了1条长度为 1176bp的基 因片段 ，测序结果与 GenBank(AY275465)相 同。荧光显 示B2R表达于质膜 。Westernblot结果显示，实验组蛋 白印迹条带与 目的蛋 白大小相 同，为 44kDa。结论 成 功构建 了pB2R-Venus重组真核表达载体 ，瞬时转染成功，获得 了转染有重组质粒的HEK293T细胞 。成功构建 的重组质粒 pB2R-Venus可用于后续 BRET、FRET等实验研究，有助于 B2R介导的信号转导机制 的探讨和药 物靶 点的寻找。 关键词 Venus；B2R；真核表达载体 ；HEK293T细胞 中图分类号 ：R346 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—9760(2014)10—309—04 Construction ofpB2R—Venuseukaryoticexpressionvectors anditsexpression inHEK293T cells JIBing-yuan，CHENGBao—hua，WANGChun—mei，et口 (NeurobiologyInstitute，JiningMedicalUniversity，Jining272067，China) Abstract：Objective ToinvestigatetheinteractionbetweenB2Randotherreceptors，andsignaltransduction mechanism ，humaneukaryoticexpression vectorthatbradykinin receptor2fusedwith Venuswasconstructed． Methods TheprimerwasdesignedbasedonhumanB2R genesequence，andB2R genewasthenamplifiedbyPCR usingplasmidpcDNA3．1-B2Rastemplate．ThePCRproductwasdigestedbyenzymeEcoRIandBamH，andcloned intoplasmidpVenus—N1．TheconstructwasidentifiedbyDNA sequencing．Therecombinantplasmidwastransiently transfectedintoHEK293