PRPS2基因shRNA质粒的构建与表达.pdfVIP

· 678 · JShanxiMedUniv，Aug2014，Vol45No8 PRPS2基因shRNA质粒的构建与表达 吴 彬 ，游锦梅 ，李 钰 ，YangYong，陈显久 (太原钢铁(集团)有限公司总医院中心实验室，太原 030003； 山西医科大学生物化学与分子生物学教研室 ；山西医科大学第一临床医学院骨科；DepartmentofEpidemiology，Medical Board，SingaporeGeneralHospital； 通讯作者，E-mail：329691788@qq．eom) 摘要： 目的 构建磷酸核糖焦磷酸合成酶2(phosphoribosylpyrophosphatesynthetase2，PRPS2)基因shRNA质粒 ，为探讨 PRPS2基因功能奠定基础。 方法 设计并合成PRPS2基因shRNA，将其分别与真核表达载体 GV102重组为shRNA质粒， 分别命名为GV102一PRPS2．1、GV102一PRPS2．2、GV102一PRPS2-3，分别转染这三种载体的细胞设为实验组 1、2、3；阴性对照载体 命名为GV102一PRPS2-0，转染该载体设为阴性对照组；分别测序鉴定。常规转染人结肠癌 HCT116细胞后采用 RT—PCR、 Westernblot检测细胞PRPS2基因的表达水平，筛选干扰效果最佳 shRNA载体。 结果 设计并合成的PRPS2干扰载体，经 测序鉴定序列正确。转染HCT116细胞后在72h内发绿色荧光的细胞数量随时间的增加而增强，转染效率均介于40％一 50％。RT—PCR和Westernblot结果显示，转染shRNA质粒的3个实验组PRPS2表达均较阴性对照组显著下降(P0．05)，其 中GV102．PRPS2—3使细胞中PRPS2的mRNA(0．27±0．05)水平下降73％、蛋白(0．30±0．04)水平下降70％，干扰效果优于 GV102．PRPS2—1(mRNA：0．61±0．03，蛋 白：0．37±0．06)和GV102一PRPS2-2(mRNA：0．89±0．02，蛋 白：0．84±0．05)。 结论 本研究利用RNAi技术下调了人结肠癌HCT116细胞中PRPS2基因的表达 ，为深入探讨 PRPS2表达下调后对细胞行为的影 响奠定了研究基础。 关键词： 磷酸核糖焦磷酸合成酶2／PRPS2； RNA干扰；HCT116细胞； 基因重组 中图分类号： Q78 文献标志码 ： A 文章编号： 1007—6611(2014)08—0678—05 DOI：10．13753／j．issn．1007—6611．2014．08．003 ConstructionanditsexpressionofPRPS2shRNA plasmid WU Bin ，YOU Jinmei，LIYu ，YANG Yong4 CHENXianjiu。 (DepartmentofCentralLaboratory，GeneralHospitalofTISCO， ， Taiyuan030003，China；DepartmentofBiochemistry andMolecularBiology，ShanxiMedicalUniversity；DepartmentofOrthopedics， FirstClinicalMedicalCollege，ShanxiMedicalUniversity；Departmentof Epidemiology，MedicalBoard，SingaporeGeneralHospital； Correspondingauthor．E—mail：329691788@qq．com) Abstract： Objective ToconstructaseriesofplasmidscontainingtheshRNAforphosphoribosylpyrophosphatesynthetase2andpro— videabasisforthestudyofthefunctionofPRPS2gene． Methods A seriesofshRNAforPRPS2weredesignedandsynthesized，and thenrecombinedwitheukaryoticexpressionvectorGV102asshRNArecombinantplasmids(experimentgroups