δ-氨基-γ-酮戊酸合成酶（ALAS）基因的克隆与原核表达.pdfVIP

第 43卷 第 6期 内蒙古师范大学学报 (自然科 学汉文版) Vo1．43NO．6 2014年 11月 JournalofInnerMongoliaNormalUniversity(NaturalScienceEdition) NOV．20l4 一 氨基一一酮戊酸合成酶 (ALAS) 基 因的克隆与原核表达 赵艳琼 ，刘 峰 ，王美玲。，李存保 (1．内蒙古医科大学 护理学院，内蒙古 呼和浩特 010059；2．内蒙古第四医院 内六科 ，内蒙古 呼和浩特 010080； 3．内蒙 古医科 大学 药学院，内蒙 古 呼和浩特 010110；4．内蒙古医科 大学 基础 医学院，内蒙古 呼和浩特 010110) 摘 要 ：为获得 AIAS的重组表达蛋 白，以人肝脏组织 cDNA 为模板 ，通过 PCR扩增得到 AIAS全长片段 并测序 ，成功构建了pET30a(+)一AIAS融合表达载体并转化大肠杆菌 Rosetta(DE)．IPTG诱导融合蛋白表达． SDS变性凝胶 电泳结果显示 ，融合蛋 白的分子量约 70kDa，并且在上清液 中有少量表达．经镍柱一步纯化得到 His6一ALAS融合蛋白． 关键词 ：8一氨基一7酮戊酸合成酶 ；重组蛋 白；基 因工程 ；RTPCR；大肠杆菌 中图分类号 ：Q987．2 文献标志码 ：A 文章编号 ：100I8735(2014)06-076605 氨基一丫一酮戊酸 (8一aminolevulinicacid，AIA)，又名 5一氨基乙酰丙酸 ，是合成卟啉、血红素、叶绿素、维 生素 B 等四吡咯化合物的代谢 中间体 ，广泛存在于细菌、真菌、动物及植物 的活细胞 中l1]．由于 AIA 是所 有卟啉化合物生物合成的关键前体 ，故在农业及医学领域都受到重视．外用 AIA是率先获得美 国食品药品 管理局 (FDA)批准用于光动力疗法 (PDT)的第二代光敏剂． AIA的生物合成有两条途径 ，其中一条是 C4途径 ，占一氨基 7一酮戊酸合成酶 (6一aminolevulinicacidsyn— thase，AIAS)是C4途径的限速酶 ]．正常情况下，AIA在体 内活细胞 中存在微量．但是在临床应用 中，需要 有大量的外源性的AIA作用于组织．生产 AIA的方法有生物合成法和化学合成法．相 比较 AIA化学合成 过程复杂且产量低 ，生物法合成 ALA具有生产过程简单 、生产潜力大等特点．AIA 的生物合成途径是 ：利 用基因重组技术使微生物细胞含有能编码合成 AIA 关键酶的基因，从而修饰代谢途径 ]，增加关键酶表 达 ，以提高酶的活力．基因工程技术的迅猛发展 ，使得 AIA生物合成途径成为可能 ，并且此技术具有较好的 定向性．本义文对 c4途径的限速酶 一AIAS基 因的克隆与原核表达进行研究． 1 材料 与方法 1．1 实验材料 E．coliDH5a、E．coliRosetta(DE3)和 pET30a均为本实验室保存 ；TaqDNA聚合酶、限制性 内切酶 Ndel和 EcoRI、dNTPs、T4DNA连接酶和碱性磷酸酶为 Takara公司产品；DNA凝胶 回收试剂盒购 自 TianGen公司；异丙基一J3一D一硫代半乳糖苷 (isopropyl』3一D—thiogalactoside，IPTG)为 Sigma公司产品；Luria Agar购 自GIBCO BRI公司；Tryptone和Yeastextract购 自OXOID公司． 1．2 实验方法 1．2．1 正常人肝脏组织总RNA的提取与反转录 取 100mg成年人肝脏组织，加入 1mITrizol后冰上匀 浆，室温放置 5min．加入0．2mL氯仿 ，剧烈混合 15～30S，室温放置 5min．4℃离心后转移水相至另一管，加 人 0．5mI异丙醇 ，颠倒混匀，室温放置 10min．4℃离心后弃上清，加入 lmI75 乙醇洗涤沉淀．4℃离心后 弃上清 ，沉淀于室温下干燥 10min．30～50 I无 RNase水溶解沉淀，55～60℃温育 10min．取 2 I进行 甲 收稿 日期 2O14-03—25 基金项 目 内蒙古 自然科学基金资助项 目(2014MS08110) 作者简介 赵艳琼 (1977 )，女 ，内蒙古丰镇市人 ，内蒙古医