环氧合酶-2的DNA疫苗构建及其在COS-7细胞中表＊达.pdfVIP

第 3O卷第 10期 西 南 大 学 学报 (自然科学版) 2008年 10月 Vo1．30 No．10 JournalofSouthwestUniversity (NaturalScienceEdition) Oct． 2008 文章编号 ：1673—9868(2008)10—0095—05 环氧合酶一2的DNA疫苗构建 及其在 COS一7细胞 中表达 罗 恒 ， 王和勇 ， 向 阳。， 唐 亮 ， 谈立松 ， 周彩存 ， 孙 敏 。 1．同济大学 附属上海市肺科医院药剂科 ，上海 200433；2．同济大学 附属上海市肺科医院肺癌免疫研究室，上海 200433； 3．西南大学 生命科学学院，重庆 400715 摘要 ：构建 了环氧合酶一2(cyc1ooxygenase一2，cOx一2)的DNA疫苗载体 pVAX1一COX一2，并考察在 COS一7细胞 中表 达．用 RT—PCR法从肺癌 A549细胞 中获得环氧合酶一2基 因片段 ，此片段插入 pVAX1载体构建 pVAX1一COX一2真 核重组表达质粒 ，脂质体介导法转染 CO 7细胞 ，以pVAX1为对照，收集稳定转染细胞 ，利用RT—PCR和 West— ern—blot分别在 utRNA和蛋 白水平上考察 C0X一2表达．实验结果表 明：RT-PCR法从 A549细胞 mRNA 中扩增 1．8kh的c0x一2基 因片段 ，酶切与测序结果表 明所构建的真核表达载体 pVAX1一COX一2与预期相符 ，质脂体法成 功地将质粒 DNA转染到 C0S^7细胞 中．RT—PCR和 Western—blot分析结果表 明COx一2已表达．因此 ，所构建的真 核表达载体 pVAXl—COX一2正确 ，且在 CO 7细胞 中表达． ． 关 键 词 ：环氧合酶一2；DNA疫苗 ；真核表达 ；COS-7细胞株 中图分类号 ：Q55 文献标识码 ：A 环氧合酶一2(CycIO0xygenase一2，COX一2)与其同工酶 COx一1是分解花生四烯酸 (Arachidonicacid)生成 各种 内源性前列腺素 (Prostaglandins，PGs)过程中关键的限速酶 ．COx酶 (EC1．14．99．1)具有环氧合 酶和过氧化酶两种活性，cOx一1在正常组织 中组成型表达 ，而 COx一2在组织 中为诱导型表达 ．研究表 明，COX一2在肺癌、乳腺癌、胃癌 、肝癌、直肠癌、结肠癌、前列腺癌与宫颈癌等肿瘤组织中高表达，而正 常组织不表达或低表达 ，主要参与细胞的生长分化，在肿瘤的发生、发展、浸润和转移中发挥重要作用．与 hTERT抗原相同，肿瘤细胞所表达的COX～2同样可被蛋 白酶体加工 ，部分 MHCI限制方式呈递在细胞 表面，产生 CTL细胞反应 ，一部分由溶酶体进一步加工 ，与 MHCI1分子结合 ，诱导特异性 CD4_‘细胞．因 此COX一2在肿瘤免疫治疗中是一个 良好的靶分子．但肿瘤细胞中所表达的COX一2抗原量难 以诱发抗肿瘤 的主动免疫反应 ，故研发具有肿瘤治疗作用 COX-2的DNA疫苗必须实现靶细胞 中过表达 ，本文拟构建 COX一2的真核高表达DNA疫苗 ，并考察在c0 7细胞 中表达 ，该质粒的成功构建与表达可为进一步将其 作为 DNA疫苗为肿瘤等疾病生物治疗奠定基础． 1 材料与方法 1．1 质粒、菌种与细胞 真核表达质粒 pVAX1购 自Invitrogen公司，pMD19一T购 自TaKaRa公司，E．coliDHSa菌株 由本室 收稿 日期 ：2008——02——25 基金项 目：上海市科委 自然基金资助项 目(06ZR14093)；上海市科委重大攻关资助项 目(05DZ19309) 作者简介 ：罗 恒 (1978一)，女 ，江苏宿迁人 ，讲师，主要从事肺癌分子药理学与生物靶 向治疗． 通讯作者：周彩存 ，教授 ，博士生导师． 96 西南大学学报 (自然科学版) 投稿 网址 http：／／xbgjxt．SWU．edu．cn 第 30卷 保存 ，COS一7和 A549细胞株购 自中国科学院上海生化细胞