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第四章 离心技术 一、 基本原理 生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。 概念 离心力 F = m·a = m·ω2 r 相对离心力（RCF）：在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是 “g” 低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速时以“g” 表示。 RCF = 1.119×10－5×(rpm)2 r 沉降系数(S)：单位离心力场中粒子沉降的速度，秒。 1S=10－13s，用S可以近似表示分子量 。 沉降系数(S) S的物理意义是颗粒在离心力作用下从静止状态到达等速运动所经过的时间。 对一定的样品，在一定的介质中，样品沉降系数S也常保持不变。 典型的S值一般在10－13s，所以该数值命名为1即1S=10－13s Svedberg单位，简写为S，纪念离心机研究先锋Svedberg。常用沉降系数以描述某些生物大分子或亚细胞器大小。 S值随颗粒质量的增加而增加，但非线性关系 二、离心机的主要类型 制备性离心机：主要用于分离各种生物材料，每次分离的样品容量比较大。 分析性离心机：一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为，能推断物质的纯度、形状和分子量等。 制备性离心机可分为三类： ⑴ 普通离心机：最大转速6000 rpm左右，室温下操作。分离形式是固液沉降分离，用于收集易沉降的大颗粒物质。 ⑵ 高速冷冻离心机：最大转速为20000～25000rpm（r/min），分离形式也是固液沉降分离，一般都有制冷系统，用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫酸铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作。 ⑶ 超速离心机：转速可达50000～80000 rpm，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，可使亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。 超速离心机装有真空系统，这是它与高速离心机的主要区别 转子主要有四种 ⑴ 角式转子：较大的容量，且重心低，运转平衡，寿命较长。但出现 “壁效应” 。 ⑵ 荡平式转子：有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带，但所需时间长 。 ⑶ 区带转子：分离效果好，但耐腐蚀要求高，操作复杂 。 ⑷ 垂直转子：离心所需时间短，但降速慢。 离心管：离心管主要用塑料和不锈钢制成 离心前管盖必须盖严，管盖有三种作用： ①防止样品外泄。 ②防止样品挥发。 ③支持离心管，防止离心管变形。 制备性超速离心的分离方法 1、差速沉降离心法： 采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。 1、差速沉降离心法： 用于分离沉降系数相差较大的颗粒和粗制品提取。 优点：操作简易，可使用容量较大的角转子。 缺点：分离效果差，沉淀于管底的颗粒容易变性失活。 2. 密度梯度区带离心法（区带离心法）： 将样品加在惰性梯度介质（蔗糖或氯化铯等）中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。 优点： ①分离效果好；②适应范围广；③能保持颗粒活性。 缺点： ①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液； ③操作严格，不易掌握。 区带离心法分为两种：（1）差速区带离心法 （2）等密度区带离心法 （1）差速区带离心法： 当不同的颗粒间存在沉降速度差时，在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法。 用于分离有一定沉降系数差的颗粒或分子量相差3倍的蛋白质。 差速区带离心法 离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束； 样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液 介质梯度应预先形成 （2）等密度区带离心法： 离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心形成梯度。 离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度区带离心法。 此法常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。 问题： 等密度区带离心法体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速有无意义？ 处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置是否受离心时间所影响？ 提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。 3、收集区带的方法 1、穿刺法 2、虹吸法