基于HCV+6Kb扩增子的动态准种优势株的确定及包膜2基因正选择位点分析.pdfVIP

7．基于HCV6Kb扩增子的动态准种优势株的确定 及包膜2基因正选择位点分析 第三军医大学西南医院全军感染病研究所(重庆400038) 朱 研 毛 青 兰 林 胡亚君 谭朝霞 张长江 王宇明 王小红 【摘要】 背量和目的。丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus．HCV)感染已成为全球性公共卫生问题．据估计全球约有 2．1亿HCV感染者．其中85％发展成为慢性丙型肝炎．现有的抗HCV治疗方案十分有限且迄今尚无有效的疫苗同世． HCV有效的免疫逃逸策略是HCV持续感染及疫苗研究困难的关键同题．但免疫逃逸的机制尚不清楚．研究表明．病毒 适应环境的高度可变性的发生机制而非宿主免疫防御功能的缺陷或损伤．可能在病毒免疫逃逸中起更重要的作用．HCV 两个显著特性．其一是准种群体内变异株的分布是不均匀的．总以一种变异株为优势株即主要变异株(dominantvari- ants)I其二是是准种的优势变异株处于动态变化中．研究显示同一个体在不同的时间点准种的主要变异株是不同的。主 要变异株的迁移可能反映了宿主的免疫压力及病毒的强大适应性。由此可见．动态变化的HCV准种优势株蕴藏着病毒 免疫逃逸的相关信息。对动态变化的HCV准种优势株长片段序列分析。以获得序列的变异特征及进化规律，是探索 HCV免疫逃逸分子基础的新途径．而建立基于HCV长序列的、准确的、动态变化的准种优势株的鉴定方法是准种优势 株相关研究的重要前提． HCV包膜2基因在HCV基因组中变异程度最高．是公认的受到宿主免疫压力即正选择压力 selection (positve pressure)作用最强的区域。位于宿主强烈免疫压力作用下的位点发生变异，可能引 起其蛋白功能发生相应的变化，有利于新的变异株发生免疫逃逸．躲避宿主的免疫清除。如果一个氨基 酸位点非同义核苷酸替代速率．(dN)显著地超过其同义核苷酸替代速率(dS)，那么我们称这个位点为 正选择位点。目前．E2基因正选择位点的相关研究报道有限。 本研究从中国人HCV感染患者系列标本库(cQueencohort)中筛选出未抗病毒治疗的1b型 effectslikeli-hood 的动态变化的准种优势株的鉴定方法。同时，用固定效应似然法(fixed method． 及其与已知功能区之间的关系。 材料和方法 1．HCV 本作为研究对象。各样本两两间隔时间为半年以上，HCVRNA≥610910 所有已知的HCVlb型全基因组序列，选择相对保守、GC含量适当的区域，设计RT引物及巢式PCR 扩增引物，其中正向引物与本研究小组已建立的5．2Kb扩增方法所用的正向引物相同，扩增产物长度 为6，030 RNase bp。采用SuperScriptTMm 及PCR条件，以期获得清晰、无杂带的6Kb的目的条带。采用高效的长片段TOPO?XLPCR克隆试 剂盒进行克隆。 2．HCV P卜3)中各随机挑选33个阳性克隆(共99个克隆)．对E2区5’端396 bp片段直接测序．采用 主要变异株发生更替的时间间隔，从33个阳性克隆中(准种复杂程度较高的时间点)随机挑选10， ·一97．一 克隆数；用第2、3例患者对上述结果进行验证。 3．基于HCV effectslikelihood WWW．hyphy．org／)内嵌的固定效应似然法(fixedmethod，FEL)检测各患者基于 6Kb长序列的E2基因的正选择位点，将所检测到的位点与E2基因已知功能区进行比对，分析各位点 的功能意义。 主要结果： 1．建立了HCV5’端6Kb长链RT—PCR扩增及高效克隆的方法：通常HCVRNA定量≥6logl0 copies／ml的血清标本扩增均可获得阳性条带，目的条带亮度高，特异性好。将PCR回收产物连接于