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兔肌肌酸激酶的分离纯化及部分性质的测定.pdf
夫 善 花 平 1999年8月
多
兔肌肌酸激酶的分离纯化
~ 第 及部分性质 的测定
.
蜒肌化学实验
glf-~, 睦坚里 张 彤 王洪睿 周海梦
—
跏酸 缎酶 — (清华大学生物科学与技术系 北京 iooos4)
实验 中
用到了多种重要的生化实验技术 ,对全面训练学生的实验能力有重要价值。
为了提高我系生化大实验课的教学水平 ,1995年我们编 制了 “兔肌肌酸激酶分离纯化及
部分性质的测定”综合性大实验 ,其中的分析鉴定方法和提取制备纯化的方法都是 目前科研中
正在使用的有效方法,因而使学生通过这一大实验直接接触到科研的前沿,受到更严格的训
练。尤其是此实验最后得到的兔肌肌酸激酶达到了凝胶 电泳和 SDS凝胶 电泳一条带的纯度 ,
可用于学生后续的分子量测定实验 ,并可直接用于科研,这是过去我们所开的各综合性大实验
未能达到的效果。在实验 中用到了多种重要的生化实验技术,对全面训练学生的实验能力有
重要作用。
1 肌酸激酶概述
肌酸激酶(CreativeKinase,CK)通常存在于动物的心脏 、肌 肉以及脑等组织的细胞浆和线
粒体中,是一个与细胞 内能量运转 、肌 肉收缩 、ATP再生有直接关系的重要激酶 ,它可逆地
催化肌酸与 ATP之间的转磷酰基反应 :
CH~
c一 :一 一 -OK(--CH2- 一 ≮NH 一-un
肌酸激酶有4种同工酶形式:即肌 肉型 (MM)、脑型(BB)、杂化型 (MB)和线粒体型 (MiMi)。
MM型主要存在于各种肌 肉细胞中,BB型主要存在于脑细胞中,MB型主要存在于心肌细胞
中,上述 3种肌酸激酶为胞浆肌酸激酶 ,而MiMi型存在于线粒体 内膜上。
肌酸激酶的纯化方法有许多种 ,本实验采用的提纯方法为改进 的 Kuby法 。该酶的测活
方法也有许多种 ,本实验采用的是 pH一比色法
2 肌酸激酶的测活方法 :pH.比色法
肌酸激酶在催化正向反应时 ,随着 ATP向肌酸上转移磷酰基的同时,生成等摩尔的 H一,
其最适 pH为 7.5~9.O,是一个宽阔的平台状 ,在此范围内测定 H一的生成速度 ,可 以作为酶活
力的指标。本实验采用百里酚蓝为pH指示剂,在分光光度计上通过pH一比色法测定肌酸激酶
的活性 ,在 597Fin1渡长下,监测吸光度的变化一在 比色皿中酶催化反应生成的H 使溶液的
pH降低,底物溶液的颜色逐渐由深紫红色变为黄绿色,吸光废值 ^ 断降低 肌酸激酶测
活的底物溶液通常可配制 20mL,当天使用 。配制方法为 :取 10mL48m/13ol,L的肌酸溶液 .加
人 1.0mL0.1mol/L的Mf;Ac:,20mL01%的百里酚蓝 ,1.0mL0.1mol/LpH9.0的Gly—NaOH
缓冲液,称 48n ATP溶于此溶液,再补加水 5.0mL,用 0.1mol/L a()H仔细调此溶液的颜色
为深紫红色即可。
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