兔肌肌酸激酶的分离纯化及部分性质的测定.pdfVIP

夫 善 花 平 1999年8月 多 兔肌肌酸激酶的分离纯化 ～ 第 及部分性质 的测定 ． 蜒肌化学实验 glf-~， 睦坚里 张 彤 王洪睿 周海梦 — 跏酸 缎酶 — (清华大学生物科学与技术系 北京 iooos4) 实验 中 用到了多种重要的生化实验技术 ，对全面训练学生的实验能力有重要价值。 为了提高我系生化大实验课的教学水平 ，1995年我们编 制了 “兔肌肌酸激酶分离纯化及 部分性质的测定”综合性大实验 ，其中的分析鉴定方法和提取制备纯化的方法都是 目前科研中 正在使用的有效方法，因而使学生通过这一大实验直接接触到科研的前沿，受到更严格的训 练。尤其是此实验最后得到的兔肌肌酸激酶达到了凝胶 电泳和 SDS凝胶 电泳一条带的纯度 ， 可用于学生后续的分子量测定实验 ，并可直接用于科研，这是过去我们所开的各综合性大实验 未能达到的效果。在实验 中用到了多种重要的生化实验技术，对全面训练学生的实验能力有 重要作用。 1 肌酸激酶概述 肌酸激酶(CreativeKinase，CK)通常存在于动物的心脏 、肌 肉以及脑等组织的细胞浆和线 粒体中，是一个与细胞 内能量运转 、肌 肉收缩 、ATP再生有直接关系的重要激酶 ，它可逆地 催化肌酸与 ATP之间的转磷酰基反应 ： CH~ c一 ：一 一 -OK(--CH2- 一 ≮NH 一-un 肌酸激酶有4种同工酶形式：即肌 肉型 (MM)、脑型(BB)、杂化型 (MB)和线粒体型 (MiMi)。 MM型主要存在于各种肌 肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞 中，上述 3种肌酸激酶为胞浆肌酸激酶 ，而MiMi型存在于线粒体 内膜上。 肌酸激酶的纯化方法有许多种 ，本实验采用的提纯方法为改进 的 Kuby法 。该酶的测活 方法也有许多种 ，本实验采用的是 pH一比色法 2 肌酸激酶的测活方法 ：pH．比色法 肌酸激酶在催化正向反应时 ，随着 ATP向肌酸上转移磷酰基的同时，生成等摩尔的 H一， 其最适 pH为 7．5～9．O，是一个宽阔的平台状 ，在此范围内测定 H一的生成速度 ，可 以作为酶活 力的指标。本实验采用百里酚蓝为pH指示剂，在分光光度计上通过pH一比色法测定肌酸激酶 的活性 ，在 597Fin1渡长下，监测吸光度的变化一在 比色皿中酶催化反应生成的H 使溶液的 pH降低，底物溶液的颜色逐渐由深紫红色变为黄绿色，吸光废值 ^ 断降低 肌酸激酶测 活的底物溶液通常可配制 20mL，当天使用 。配制方法为 ：取 10mL48m／13ol，L的肌酸溶液 ．加 人 1．0mL0．1mol／L的Mf；Ac：，20mL01％的百里酚蓝 ，1．0mL0．1mol／LpH9．0的Gly—NaOH 缓冲液，称 48n ATP溶于此溶液，再补加水 5．0mL，用 0．1mol／L a()H仔细调此溶液的颜色 为深紫红色即可。