RNA干扰抗矮花叶病转基因玉米培育.pdf

摘要 玉米矮花叶病是由玉米矮花叶病毒感染引起的病害，在全国及世界各玉米产区 均有流行，对玉米生产危害严重。目前，玉米矮花叶病的防治主要有调整播期、清除 杂草和拔除病株等农艺措施和传播媒介昆虫的化学药剂控制。但是，由于玉米矮花叶 病毒主要靠蚜虫以非持续性的方式传播，这些防治措施不仅增加生产成本，而且防治 效果欠佳，往往不能有效解除矮花叶病对玉米生产的危害。选育推广抗病品种是防治 玉米矮花叶病最为经济的途径。但是，由于抗病种质资源有限，抗病性的遗传性质复 杂，在常规抗病育种中很难将抗病性与产量、品质等优良的农艺性状有机结合，培育 出满足农业生产需要的抗病品种。 由双链RNA介导的RNA干扰，可特异性地降解细胞内与双链RNA同源的mRNA， 限制同源基因的表达。本研究根据RNA干扰的原理，克隆玉米矮花叶病毒外壳蛋白 载体，通过农杆菌介导法转化玉米自交系“18．599’’的胚性愈伤组织，筛选分化再生 性鉴定，并用荧光定量PCRTffl双抗体夹心酶联免疫吸附分析检测转基因株系与对照玉 米矮花叶病基因表达量和病毒蛋白积累量，以期创造高抗矮花叶病的转基因种质材 料，并为转基因抗病品种培育提供参考。 1．玉米矮花叶病毒基因RNA干扰表达载体构建 在OenBank数据库中，对玉米矮花叶病毒的CP基因和尸1基因进行序列同源性分 析，分别选取CP基因长度为100和404 bp，P1基因长度为150和451 bp的保守序列，体 外化学合成，通过PCR扩增引入限制性酶切位点，限制性酶切后定向克隆至中间载体 pSK—int，构建反向重复序列结构。再经限制性酶切后，分别插入植物表达载体 1 1。 pASC404、pASP50和pASP45 2．玉米胚性愈伤组织的转化与再生植株的分子检测 以玉米自交系“18．599”的未成熟胚为外植体，诱导培养胚性愈伤组织，建立转 基因受体系统，用农杆菌介导法转化，潮霉素抗性培养基梯度筛选后分化再生植株。 l Southern杂交检测有2l、20、9和17个Tl代株系表现阳性，大多数为单拷贝插入。 在实验过程中，对基于N6培养基的玉米愈伤组织分化再生技术作了改进。在再 生培养基中添加低浓度(0．25 mg／L)烯效唑(S3307)和适量(O．5mg／L)ABT生根 粉，对再生植株生根壮苗有促进作用，再生成活率显著提高。 3．转基因株系抗病性鉴定 9和15个T2代株系按随机区组种植，以非转基因“18．599’’、抗病自交系“H9．21’’ 和感病自交系“M017为对照，人工摩擦接种玉米矮花叶病毒，调查发病株率和 发病程度，计算病情指数，鉴定各转基因株系的抗病等级。由pASCl00转化的4 个T2代株系有3个株系表现中度抗性，病情指数显著低于非转基因对照“18．599， 系的抗病等级达到抗性水平，其中4个株系的抗性高于抗病对照“H9．21’’，但在 抗病等级鉴定为感病的4个株系中有2个株系Southern杂交证明外源基因为双拷贝 插入；在pASPl50转化的9个T2代株系中，有3个株系表现中抗，病情指数显著 低于非转基因对照“18．599”，但与抗病对照“H9．21”差异不显著，其余6个株 系表现为感病，其中2个株系外源基因为双拷贝插入；由pASP451转化的15个T2 代株系抗病性均较“18．599’’提高，其中6个株系达到抗性水平，4个株系的抗病 等级高于抗病对照“H9—21，在表现中抗的8个株系中有2个为双拷贝插入，表 现感病的1个株系为三拷贝插入。转基因株系的抗病性与插入外源反向重复序列的 长度和拷贝数有关。 4．矮花叶病毒基因在转基因株系中的表达量和蛋白积累量 1转化的T2代株系及对照顶部 田间接种鉴定后，取pASCl00、pASC404和pASP45 第三片叶，提取总RNA，反转录cDNA，实时荧光定量PCR检测矮花叶病毒基因的表 达量。矮花叶病毒CP和尸l基因在抗病转基因株系及抗病对照“H9．21”中的表达量， 明显低于在感病对照“M017和非转基因对照“18．599中