VEGF反义核酸对多药耐药细胞HL60%2fVCR耐药性逆转与实验研究.pdfVIP

的实验研究 专业名称： 儿科学 学位申请人：张晓红 指导老师： 李文益教授 中文摘要 多药耐药(multidmg 的一个重要原因之一。其产生是多因素、多机制综合作用的结果。关于多药耐药 的研究，既往大多着眼于肿瘤细胞本身的生物异质性，而往往忽略了宿主因素， 尤其是细胞所处的造血微环境的作用。近年来的研究发现，造血微环境提供了细 胞生存、增殖的土壤，细胞外基质及其分泌的多种细胞因子的作用日益受到重视。 造血微环境可形成内稳态，通过多种途径影响着血液肿瘤细胞的生物学特性，包 括耐药表型。深入研究造血微环境，将为多药耐药和微小残留病变的治疗提供新 的靶点。针对造血微环境所表达的特殊蛋白的治疗，对正常组织的影响小，同时 对于转移灶和微小残留病变的针对性强，有望成为克服难治性血液肿瘤多药耐药 的一种有效途径。 endothelial 血管内皮生长因子(vascular factor，VEGF)是一种具有 growm 肝素结合活性的生长因子，通过自分泌和旁分泌的方式作用于白血病细胞和微环 境中的基质细胞，不仅在血管生成中起调节作用，而且在细胞的增殖过程中发挥 了重要作用。一方面，VEGF以旁分泌的形式调节白血病的血管生成，还通过血 殖。另一方面，白血病细胞分泌的VEGF作用于本身，维持自身存活、增殖、 阻止白血病细胞凋亡，增强白血病细胞对放化疗的抵抗作用，并引起细胞迁移。 目前，以VEGF及其受体为靶点的研究中，反义核酸是一种较有前景的方 法。它不仅直接特异的封闭基因表达，而且少有毒副作用。因此本研究选择白血 病细胞vEGF自分泌和旁分泌环的共同上游，阻断VEGF的自身分泌，观察白 血病和耐药白血病细胞的生物学行为(细胞增殖，细胞凋亡，相关基因表达，耐 药白血病细胞的致瘤性)的改变。探讨VEGF在逆转白血病耐药中发挥的作用 及机制，为临床耐药白血病的治疗提供一条新的选择途径。 研究内容： 1．建立VEGF反义核酸真核表达体系，为VEGF反义核酸的体内和体外研 究建立方法学基础。 2．研究VEGF反义核酸对白血病细胞和耐药白血病细胞生长的影响。 3．研究VEGF反义核酸对耐药白血病细胞对化疗药物敏感性的影响。 4．建立白血病多药耐药动物模型。 5．研究VEGF瘤体原位注射及与化疗药物联合应用对荷瘤鼠生存的影响。 研究方法： 1．构建VEGF反义核酸真核表达载体从K562细胞中抽提RNA，ImPCR 反义核酸表达质粒AS-pcDNA3．3．1．VEGF，筛选并鉴定阳性质粒，扩增质粒。 2．vEGF反义核酸对白血病细胞生长的影响通过脂质体转染技术将 细胞，观察不同细胞生长抑制情况，ELISA方法检测培养细胞VEGF表达， ImPcR方法检测耐药相关基因表达，流式细胞术检测细胞周期变化，wESTERN BLOT检测P—gp蛋白表达。 3．VEGF反义核酸联合化疗药物对耐药白血病细胞的影响采用脂质体转 法检测培养细胞vEGF表达，ImPCR方法检测耐药相关基因表达，流式细胞术 检测凋亡情况。 4．建立多药耐药荷瘤鼠模型 lI 观察肿瘤生长及转移情况，建立多药耐药荷瘤鼠模型。 5．VEGF反义核酸治疗耐药白血病的研究将荷瘤鼠分为3组，VCR组， 射与VCR腹腔注射后，观察各组裸鼠的生存情况，外周血数量和细胞形态学改 变，病理切片观察不同部位的肿瘤负荷，RT-PCR方法检测不同部位肿瘤组织 vEGF、MDRl表达改变。 研究结果： AS-pcDNA3．3．1．VEGF含有反向插入的VEGFl21。 2．1．25umol／mL HL60ⅣCR细胞72h时，转染效率最高，荧光细胞达51±2．4％。 II