巢式-多重RT-Realtime+PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系的方法.pdfVIP

2010年进出境植物检疫学术研讨会论文集 巢式一多重RT—RealtimePCR检测马铃薯Y 病毒脉坏死株系的方法 粟智平耿金培 杨益娥 钟响 张京萱 (烟台出入境检验检疫局山东烟台264000) 物和一条TaqMAN荧光探针，建立了巢式一多重RT—RealtimePCR检测PVY“的新方法。该方法有机地 结合了巢式PCR、多重PCR和探针检测技术。实验结果表明，本方法检测的准确性和灵敏度比巢式PCR、 time 单重Real 阳性产物进行确认，检测的准确性比其它方法高。 关键词马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVYN)；巢式一多重RT—RealtimePCR；检测 virus 马铃薯Y病毒(PotatoY，PVY)是马铃薯 中一种最重要的病害之一，严重的减产可达80％以 l材料与方法 上，甚至绝产。PVY是马铃薯Y病毒科、马铃薯Y1．1实验材料 病毒属的代表种，分布于所有马铃薯种植区。马铃 马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVY“)、南芥菜花 薯Y病毒目前已有多个株系被鉴定，目前认为PVY 有3个株系，其中普通株系(PvYo)世界范围内广环斑病毒(PBRSV)毒源及病毒接种寄主白肋烟由 泛分布，坏死株系(PVY“)主要发生在欧洲、非洲、中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所提供。 美国南部和加拿大东部地区，C株系(PVY‘)在北接种繁殖由烟台出入境检验检疫局完成，健康大豆 美洲不发生1。马铃薯Y病毒脉坏死株系是马铃薯 叶为阴性对照(CKl)。 等作物中一个非常重要的植物病毒病害，在我国东 主要的仪器及试剂见参考文献3。 北和黄淮烟区为害严重2。 1．2 TaqMAN探针与引物的设计合成 检测马铃薯Y病毒(PvY)的方法主要有 根据PVY“基因组中RNA依赖的RNA聚合酶 ELISA、电镜技术和RT—PCR技术3。这些技术操 (DRP)基因序列保守区域，设计一条TaqMAN探针 作步骤繁琐、检测周期长、灵敏度低，且易于造成环 和两对引物，探针57端标记FAM，37端标记TAM． 境交叉污染，出现假阳性结果。还未见采用实时荧 RA，引物与探针由TaKaRa合成。 光PCR检测该病毒的研究报道。 本研究中巢式多重RT—RealtimePCR引物序 本研究建立了一套“巢式一多重一RT—Real— time PCR”检测ⅣY“的新技术。该命名的依据： (1)按巢式PCR原理设计两对引物，中心的一对引 物称为巢式引物(用C表示)，上下游引物分别用 W2序：5一 cl、C2表示；夕f、围的一对引物称为外围引物(用W 表示)，上下游引物分别用W1、W2表示；(2)两对 引物，在一个PCR管中反应，形成四重PCR反应； (3)这两套引物共一条TaqMAN探针，在PCR扩增组合中，C1／C2所对应的PCR产物长度为225bp； 中采用了实时荧光PCR检测原理。与目前已报道 的其它检测方法相比，巢式一多重RT—Realtime PCR检测技术具有更准确、灵敏、快速、简便等 的PCR产物长度为349bp。 特点。 1．3总RNA提取及质量控制 一197— 2010ft女№U*☆^}$Hd§*t} I 4反转录合成eDNA l 5实时荧光PCR蛮验 1 51特异性实验 N^为模板．加^引物ci、C2、W1、W2和探钳．进行 l 5 2建敬度实验 巢式多重宴肘荧光PCR变验，以检测这纽引物‘j I 5 3单重RT—ReahimePCR与巢式多承RT 探引的特异性(图1)。嘲l的结粜娃爪．该组引 —R