a-淀粉酶在疏水作用色谱中保留热力学研究.pdfVIP

第十一届肢体与界面化学会议论文集 0【．淀粉酶在疏水作用色谱中保留的热力学研究料 趔，耿焦照：三吴丹2，雷祖猛1，冯小艳1，耿蓓笃2 (1．西安工程大学，环境与化学工程学院，陕西西安710048；2．西北大学，现代分离科学研究所，陕西西安 710069) interaction 疏水作用色谱(hydrophobic 分子的生物活性和分子立体构象的优点，已被广泛应用于生物大分子的分离和纯化．在HIC中生物 大分子的分离主要受流动相组成以及温度的影响．迄今为止，文献中对流动相组成与蛋白保留关系 的研究较多，但从热力学角度对蛋白质在HICSb保留行为的研究较少．主要原因是随温度变化，蛋白 质分子构象会发生变化，使热力学研究变得较为复杂．研究蛋白质在HIC中保留的热力学参数，对从 分子水平理解生命体内的疏水相互作用力、蛋白分子的热变性都有重要意义。 本文研究了在20～35℃范围内，经不同浓度盐酸胍变性的Ⅱ．淀粉酶(a-Amy)在高效液相疏水 都很好地遵循非线性Van’t Hoff方程…，其保留值都随温度的升高而逐渐增大。并且求算出a．Amy 在HPHIC中保留的热力学参数(△}￡△义△G和△@发现n．Amy在保留过程中的四个热力学参数 均随温度的变化而变化；在实验温度范围内，a-Amy分子的焓变和熵变值几乎都为正值。这说明在实 验温度范围内，Ⅱ．Amy保留过程中的熵增抵消了不利于保留的焓变，从而使溶质的自由能降低，使 大，a-Amy保留过程中的自由能负值逐渐增大，符合高盐浓度更利于蛋白保留的规律。在相同的盐 浓度和温度下，随着盐酸胍浓度的增大，a．Amy保留过程中的自由能负值也逐渐增大，表明a．Amy 经盐酸胍变性后，其分子构象发生变化的同时，分子内部的疏水性氢基酸残基外露，增加了蛋白质 分子与HPHIC固定相表面的疏水强度，使其更易在疏水填料上保留。焓变、熵变和热容量变三个热 力学参数都与绝对温度的倒数之间存在线性关系．保留过程中天然a-Amy的焓、熵值都随着温度的 升高而线性降低，而经不同程度盐酸胍变性的a—Amy，其焓、熵值随着温度的升高却线性增大，表 明胍变a-Amy分子的构象发生变化，分子内部疏水性氨基酸残基外露，增大了其与疏水固定相的相 互作用力，故其变化规律和天然a-Amy恰好相反。热容量，不管是天然a-Amy，还是胍变a-Amy， 都随着温度的升高而线性降低，但降低程度缓慢。同时，依据液一固界面上溶质计量置换保留理论 负值，符合变性蛋白能量高于天然蛋白能量的理论预计。而且，AAGF数值均在几十kJ／mol以上， 比在溶液中的折叠自由能(一般为几到十几kJ／mol【31)高出很多，这与液．固界面上的物理化学性质 高的能量，也证明其变性程度最大。在疏水色谱中，固定相表面键合有适度疏水强度的配基，在高 ’通讯作者：Email：蛐ggeng@153．tom，电话：029 “国家自然科学基金资助项目、西北大学现代分离科学研究所开放基地和p文西省教育厅访问学者资助项 目 2007年7月24．28日中国-福州 盐浓度的环境中，变性蛋白折叠受到的疏水作用力将其推向固定相表面，从HIC表面获得能量，完 蛋白在液一固界面上的折叠自由能会高于在溶液中的折叠自由能．从不同的起始态折叠到相同的终止 态，变性蛋白在液一固界面上的折叠自由能高出在溶液中的折叠自由能部分可能归结于疏水固定相能 为蛋白折叠提供更多的能量． 参考文献 Cs．Retention in Interaction 【l】VailayaA，Horvatll ThermodynamicsHydrophobic 1996，35：2964． 【21 耿信笃，白泉，王超展．蛋白折叠液相色谱法．北京：科学出版社，2006，197． C．Protein Protein 【3】Tanford denaturayion．AdvChem，1968，23，121·282． X X interaction toolfor 【4】 GengD，ChangQ．High—performancehydro