Flavopiridol体外诱导人尤文肉瘤细胞凋亡机制研究.pdfVIP

Flavopiridol体外诱导人尤文肉瘤细胞凋亡机制的研究 李旭 朱悦 王禹祥 范广宇 中国医科大学附属第一医院骨科，辽宁沈阳110001 儿童恶性骨肿瘤中，尤文肉瘤(Ewingsarcoma，ES)的发病人数仅次于骨肉瘤，其恶性度高，早 期即发生转移，最新的流行病学显示尤文肉瘤的5年生存率仍然低于50％，因而新的分子靶向治疗 药物的开发和应用迫在眉睫。目前研究表明，尤文肉瘤细胞中异常表达的融合蛋白EWS-FIil造成细 胞周期蛋白依赖激酶(CDK)的异常活性化和其抑制因子的失活，这可能是诱发尤文肉瘤细胞无限增 殖抑制作用及其机制。 1材料与方法 van 1．1材料人尤文肉瘤细胞株1]l『E一68由德国明斯特大学F 和caspase一8抗体购自美国肋BiosciencesPharmingen公司，actin抗体购自美国SantaCruz公 司。其它试剂均为国产分析纯试剂。 1．2 方法 1．2．1细胞培养人尤文肉瘤细胞株117E_6在含lO％胎牛血清的RPMl1640培养液于37。C，596c02 条件下培养，0．25％胰蛋白酶消化传代。 100u 至72h。每组终止培养前加入MTT(59／L)20|lL，继续培养3—4h后离心，弃上清，加DMS0200|lL， 避光震荡15min，在全自动酶标仪上测定570nto处吸光度A值，描绘细胞增殖曲线计算细胞生长抑 制率。 PI染色30min，过网，用流式细胞仪测定DNA含量的变化，分析细胞凋亡和细胞周期，低于G。期DNA 含量的细胞为调亡细胞。 1．2．4免疫印迹(western 胞，Laemmli u SampleBuffer裂解细胞后行聚丙烯酰胺凝胶电泳；每孔加样20 g，转移至PVDF膜 二抗(辣根过氧化物酶标记，1：2000稀释)室温孵育lh；TBST洗涤同前，ECL化学发光显色。 1．2．5统计学方法：采用SPSSIO．0软件处理系统进行统计学分析，实验数据以x±S表示。统计 学方法采用单因素方差分析(ANOVA)，以P0．05为差异有统计学意义。 2结果 2．1flavopiridol对人尤文肉瘤细胞株WE-68的体外增殖抑制效应 增加以及作用时间的延长，wE一68细胞的生长抑制率逐渐升高，抑制作用呈剂量一效应及时间一效应 _l墨l翻望丝笪全笪壁丝型叁些 !塑三!竺!!：!!兰堑 依赖性(尸0．05)。 2．2flavopiridol对wE～68细胞周期的影响 给药浓度的增加而逐渐上升，各实验组与对照组差异均有统计学意义，PO．05。。 2．3 表达水平的影响 应具有剂量相关性。 3讨论 kinase，CDK)抑制剂，化学结构为黄酮，最初来源于一种印度植物，现已可人工合成，对多种癌细 胞具有增殖抑制作用。 对尤文肉瘤细胞wE的生长具有强烈的抑制作用，并呈剂量、时间依赖性。通过细胞周期测定，发现 其抑制作用主要来源于flavopiridol对尤文肉瘤细胞的凋亡诱导作用。诱导细胞凋亡被视为近年来 抗癌药物研究和开发的新靶点，通过调控细胞信号转导系统诱导细胞凋亡来治疗癌症正成为目前肿 瘤学领域研究热点之一。在调控细胞凋亡的众多的信号转导系统中，以caspase-8激活为触发点的 死亡受体激活途径，以及由bcl-2和bax等调控的线粒体激活路径，是细胞凋亡信号转导的两大基 本途径。Bcl-2及bax均属于bcl一2家族成员，是细胞凋亡线粒体激活路径中的主要调控基因，二 者的蛋白表达的比率可控制细胞对死亡刺激的相对反应性，这在控制细胞凋亡途径中起重要作用， 尽管有研究表明，bcl-2可能参与FP诱导的细胞凋亡，本实验中FP给药前后凋亡抑制基因bcl-2 直接的早期应答基因，其功能为启动细胞凋亡，本实验中所使用的WE-68细胞为表达野生型p-53的 细胞株，但bax的表达在FP给药前后无变化，