动物饲料中呋喃唑酮酶联免疫吸附检测法研究.pdfVIP

， ‘‘京津冀畜牧兽医科技创新交流会暨新思想、新观点、新方法论坛”论文集夕∥汐 定的影响。 5结论 综合分析日粮中添加60mg／kg的苜蓿皂甙效果最佳。 参考文献(略) 动物饲料中呋喃唑酮的酶联免疫吸附检测法研究 张会彩刘聚祥刘静王建平1 (河北农业大学动物科技学院，河北保定，071000) 摘要：本文分别采用重氮化法和戊二醛法将呋喃唑酮与牛血清白蛋白偶联，免疫家兔制备抗呋喃 唑酮抗血清，建立了检测鸡饲料和猪饲料中呋喃唑酮的ELISA方法。结果表明，该抗体与呋喃妥因和 呋喃西林分别有8』％和38％的交叉反应率，该ELISA法对呋喃唑酮的检测限为0．8ng／g。在鸡饲料 和猪饲料中分别添加，o一160mg／kg的呋喃唑酮后，回收率范围为7r2．3％一98．5％，变异系数范围 为反2％～10．5％。 关键词：呋喃唑酮；酶联免疫吸附法；鸡饲料；猪饲料 促生长作用曾广泛用于禽畜和水产养殖业中，现存仍然是中东及远东地区国家的一种使用较广的药 物。但呋喃唑酮毒性较大，易使动物出现毒性反应甚至引起死亡。而且，Fz在动物组织中的残留对 消费者具有潜在的致癌和诱导突变作用。出于对动物性食品安全的考虑，中国、欧盟和美国均明确规 定禁止硝基呋喃类药物在所有食品动物养殖中使用。但由于Fz具有高效廉价的特点，在我国畜牧 养殖过程中仍然存在非法添加至饲料中使用的情况。2002—2003年间，曾因我国出口至欧盟的鸡肉 和水产品中检测出硝基呋喃类药物残留而给我国动物性产品出口贸易造成过巨大的损失。 目前，国内外许多研究者都已经开展了动物饲料及产品中¨．2oFZ残留检测方法的研究。主要有 高效液相色谱法和液相色谱一串联质谱法。以上方法均需要昂贵的仪器，且过程繁琐，不能实现快 速、大批量检测的目的。而酶联免疫吸附检测法(ELISA)是一种快速筛选方法，可弥补仪器检测的缺 点。目前，国内外研究者对动物饲料及动物性产品中Fz的免疫检测研究还未广泛开展，只有罗杰 等旧。对水产品中的FZ进行过ELISA检测的研究报道。因此，本研究的目的就是建立一种快速，灵敏 地检测动物饲料中Fz的酶联免疫吸附法，监控畜牧养殖业中Fz的非法使用，以保障动物性产品质 量安全，同时为研制Fz快速检测试剂盒或试纸条奠定基础。 1材料与方法 1．1 药品与试剂 甲基联苯胺(TMB)，弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司。羊抗兔lgG一辣根过氧 邮编：071000 ／彩 ··京津冀畜牧兽医科技创新交流会暨新思想、新观点、新方法论坛，-论文集 化物酶购自华美生物工程公司。其他试剂均为分析纯。 I．2主要仪器 USA SUNRISE酶标仪，TECAN 器有限公司。 1．3 实验动物 6周龄(1．5公斤)的新西兰白兔6只。 1．4呋喃唑酮人工抗原的合成 重氮化法：采用改进重氮化法合成Fz免疫抗原FZ—BSA，具体方法如下：(1)还原：称取Fz 55mg，溶于乙腈一甲醇混合液，加入10mL 置于4oC冰箱中冷却。(2)重氮化：用1mol／L盐酸调节pH近l，逐滴加入0．5mol／LNaNO，溶液 1mL，搅拌反应至淀粉碘化钾试纸检验呈灰蓝色为止。用 mol／LNaOH N，N一二甲基苯胺检测重氮化是否成功，用氨基磺酸胺去除多余的亚硝酸钠，用1 调pH至7．5。(3)偶联：将所得溶液缓慢加入到10mL ℃搅拌反应12h，然后在生理盐水中透析72小时。最后分装，一20℃保存。包被抗原FZ—OVA的合 成方法与此相同。 戊二醛法：采用戊二醛一步法合成fZ免疫抗原FZ—BSA，具体方法如下：(1)还原：过程同重氮 化法。(2)偶联：将反应l液边搅拌边缓慢滴加到lOmL 然后逐滴加入25％的戊二醛溶液100uL，室温反应4小时。然后在4。C生理盐水中透析72小时。分 装后一20℃保存。同法合成包被抗原FZ—OVA。 完全抗原合成后采用紫外全波长扫描法进行鉴定，并计算偶联比。 1。5呋喃唑酮抗血清的制备 ． 首次免疫，取FZ—BSA与等量弗氏完全佐剂，充分乳化后对新西兰白兔背部皮下多点注射，加强 免疫以抗原与弗氏不完全佐剂乳化后皮下注射。每隔3周加强免疫一