RAPD-PCR快速鉴定啤酒污染菌研究.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四次奎嗣发酵工程学术讨论套论文集 RAPD--PCR快速鉴定啤酒污染菌的研究 郑飞云，朱林江，李永仙，李崎，顾国贤 (江南大学教育部工业生物技术重点实验室，扛苏无锝214036) 摘要：本文主要评价RAPD--PCR技术在快速鉴定啤酒污染菌中的应用．首先评价了 CTAB法和试剂盘提取DNA模板对RAPD指坟稳定性的影响以及乳酸酋专一性BPgl曲 扩增的16SrDNA的5’末墙740bp序列用于鉴定菌种的可行性，呆用PCR产物直接测序鉴定 分离的污染曹．构建标准污染菌库。对分离苗M--13的RAPD指纹聚类分析表明相同来豫 的同一种茴舻很好地归粪在一起．根据建立的快速鉴定流程和初步确定的苗和相似性阁值 (SCC)．对8株分高菌的鉴定表明RAPD--PCR技术是一项简单、快捷、可靠性强的鉴定技 术，为研究啤檀破造过程的污染菌提供一十非常有用曲快速鉴定工具． ‘ M一13 关键词：啤酒污染菌；RAPDp CTAB，相似性闻值f 随着啤酒酿造过程自动化程度不断提高和灌装技术不断改进，啤酒污染菌已不再是 影响啤酒酿造和贮存的主要因素，但是为了确保啤酒生产安全，产品质量稳定，对每一批 酿造样品进行跟踪检测微生物必不可少。目前市场需求量不断增加的纯生啤酒酿造对 扮染微生物的控制提出更高要求。另外，不同污染菌的危害程度不同n]。对培养基检测 并分离得到的污染菌进行快速鉴定对啤酒生产具有重要的指导意义。 随着分子生物学的迅猛发展，新的快速鉴定技术不断涌现，如全细胞蛋白质sDs— PAGE图谱鉴定技术，将基因组酶切后进行脉冲凝胶电泳的电泳图谱分析(PFGE)、随机 的rep--PCR、通过酶切消化后用酶切位点专一性的引物选择性扩增基因组DNA，得到 进，其重复性和鉴定能力已经被人们接受。结合计算机软件处理已经构建了一些快速鉴 定的数据库，如针对乳酸菌的垒细胞蛋白质SDS—PAGE数据库口]、总基因组DNA的 - RFLE指纹数据库r,o和针对乳制品分离菌的RAPD指纹数据库[s3。 spp．和Pediococcus spp．这两类乳酸菌中的一些菌种，但由于啤酒污染菌的腐败啤酒能 力是菌株依赖性，且不同菌株的指纹之间存在一定差异，所以不能用现有的乳酸菌指纹 鉴定啤酒污染菌，必须构建针对啤酒污染菌指纹数据库。在众多快速鉴定技术中，RAPD 三个亚种“]。也能快速区分基因型上十分相似的Lactobacillus 作者简介：郑飞云，男(1974一)，浙江乐清人，讲师，Tel：0510- E--mailI feiyunzh@sytu．edu．cn． 第四次全国发酵工程学术讨论会 较好的重复性。所以本次研究主要是构建来自啤酒厂污染菌的RAPD指纹数据库及其 在快速鉴定中的初步应用。 1材料和方法 1．1啤酒污染菌及培养条件 本次研究的污染菌主要是从两个地理位置相差较远的啤酒厂，分别分离纯化而得到 了38株和21株污染菌；还有12株是从实验室麦芽的表面分离}另外加上12株是实验室 buchneri 保藏的分离菌株，以及两株标准菌即Lactobacillus cns。i JCMll34。分离纯化啤酒污染菌所用的选择培养基是添加有酒花、放线菌酮的麦汁 培养基。富集培养污染菌时采用M—MRs培养基，其厌氧培养条件如文献[83报道。 1．2 DNA提取方法 比较了先前确定的cTAB(十六烷基三甲基溴化胺)法口1和上海生工生物工程技术 白分析仪80一2114—98上分析浓度和纯度。 1．3乳酸菌专一性引物初步鉴定分离菌株 对分离菌的初步鉴定采用BP。和P珐引物，反应体系和扩增程序同文献“3报道。 1．4 DNA测序鉴定分离菌 物扩增的740bp用于鉴定菌种的可靠性。