基于M蛋白检测犬瘟热抗体ELISA方法的建立_张敏.pdfVIP

Online system: 农 业 生 物 技 术 学 报 Journal of Agricultural Biotechnology 2015, 23(4): 554~560 DOI: 10.3969/j.issn. 1674-7968.2015.04.015 基于M 蛋白检测犬瘟热抗体ELISA 方法的建立 1 2 1 1* 1* 张敏 黄京书 娄亚萍 赵阿勇 王晓杜 1 浙江农林大学动物科技学院，杭州311300 ；2 湖北省畜牧兽医局，武汉430070 * 通信作者，zay503@163.com；xiaoduwang@ 163.com 摘 要 犬瘟热病毒(Caninedisrempervirus, CDV)是导致犬科等多种属动物发热、腹泻、幼仔死亡等症状的 传染病病原体，建立针对CDV 的快速灵敏的诊断方法对于该病的防治具有重要意义。本研究利用RT-PCR 方法扩增得到CDV-M基因，构建原核重组表达载体pET-28(a)-CDV-M，并在大肠杆菌(Escherichiacoli) 中实 现了该蛋白的表达和纯化，Western blot 验证重组蛋白的抗原性，用纯化的重组蛋白his-CDV-M 作为抗原包 被酶标板，ELISA 方阵实验确定该重组蛋白的包被浓度，建立了检测临床犬血清样品的CDV-M 蛋白抗体 的间接ELISA 方法，比较本实验方法与其他试剂盒之间的特异性和灵敏性。结果表明重组蛋白his-CDV- M 得到较好表达，纯化后蛋白浓度为2.840 mg/mL 。Western blot 结果表明重组抗原能与犬瘟热阳性血清进 行反应。方阵实验确定抗原最佳工作浓度为8.88 μg/mL，抗体最佳稀释度为1∶160，应用本方法检测223 份 犬血清样品，与进口CDV 诊断试剂盒检测结果符合率为96% 。本研究建立的基于M 蛋白的犬瘟热病毒抗 体检测方法具有较高的特异性和灵敏性，为犬瘟热病毒的诊断及M 蛋白的功能研究提供了工具。 关键词 犬瘟热病毒(CDV)，重组M 蛋白，原核表达，间接ELISA Establishment of an Indirect ELISA Based on Matrix Protein of Canine distempervirus ZHANG Min1 HUANG Jing-Shu2 LOU Ya-Ping1 ZHAO A-Yong1* WANG Xiao-Du1* 1 College of Animal Science and Technology, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Hangzhou 311300, China; 2 Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Hubei Province, Wuhan 430070, China * Corresponding authors, zay503@163.com; xiaoduwang@ 163.com Abstract Caninedistempervirus (CDV), which causes fever, diarrhea, even death of Canidae and other animals, is a pathogen hazards of infectious diseases. It is important to diagnosis and control diseases using rapid and sensitive method of detecting CDV. In the work, M gene of CDV was cloned by RT- PCR from cDNA of clininal samples. The plasmid of pET- 28(a)- CDV- M was constucted and identified by PCR a