聚乙烯亚胺修饰的白蛋白微泡转染CHO细胞实验研究.pdfVIP

聚乙烯亚肢修饰的白蛋白微泡转染 CHO 细胞实验研究 基因治疗是治疗肿瘤、感染、免疫缺陷和心血管系统疾病的一种有效方法， 但成功的基因治疗高度依赖于有效、安全的转运载体。基因转运载体分为病毒载 体和非病毒载体，虽然病毒载体转染率较高、能稳定持久地表达所携带的外源目 的基因，但其免疫原性和潜在致突变性限制了其使用。非病毒载体因其使用简单、 能够大规模生产以及缺乏免疫原性等优点受到广泛关注。近年来本课题组采用自 行研制的白蛋白微泡在超声作用下破裂可以促进其携带的外源基因进入靶细胞， 但转基因效率较低，故如何提高白蛋白微泡转基因效率一直是研究重点。本研究 在制作白蛋白微泡时加入阳离子聚合物 聚乙烯亚胶，不仅通过提高微泡的表 面电位，增强了微泡结合 DNA 的能力，还提高了转基因效率、微泡的稳定性， 且降低 PEI 的细胞毒性。 材料和方法 中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)、真核表达载体 pIRES2-EGFP 质粒、大肠杆菌 ToplO 由本研究所提供， DMEM 培养液、 Opti→MEM 禄 R 及胎牛血清 (FCS， Hyclone，北京)，无内毒素质粒大提试剂盒 (Tiangen，北京)， Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美国)， 25%人体白蛋白 (Albumin， Bayer，德国)， PEI (Sigma- Aldrich，美国)，聚乙二醇 (PEG4000， polyethyleneglycol , Merck，德国), Cell Counting Kit-8 (CCK-8 , Dojindo，日本) ，荧光显微镜(日本 Olympus-CK40) • 流式细胞仪(美国 Beckman←Coulter FC500) 美国 PSS 激光粒度仪(上海惠翼 流体设备工程有限公司)， Zeta 电位分析仪(美国 Colloidal Dynamics) .声振微 泡制剂试验仪 (无锡市人民医院)。 实验方法 将 25%人体自蛋白、 PEI (分支状，分子量 25000)、 PEG (分子量 4000) 和葡萄糖按一定的质量比混合后用超声振动仪声振 20s，制得 PEI 修饰的白蛋白 微泡 (PAMB)。然后用纳米激光粒度仪和 Zeta 电位分析仪检测其直径和表面电 位。 pIRES2-EGFP 质粒转化大肠杆菌ToplO，卡那霉素筛选后挑选单克隆扩增， 参照质粒抽提试剂盒说明书抽提纯化定量，琼脂糖凝胶电泳鉴定其长度为 5.3kb。 该质粒含有巨细胞病毒启动子调控的编码增强绿色荧光蛋白 (GFP)cDNA 序列， 其表达产物在活细胞内可以使用荧光显微镜和流式细胞仪直接检测。才夺质粒 DNA 与 PAMB 按一定的比例混合后加入SYBR Green, SYBR Green 与 DNA 结 合后可被激发出绿色荧光，在荧光显微镜τ观察，结合质粒 DNA 的微泡可发出 绿色荧光。 统计学分析 计量资料以均数土标准差 (x士s) 表示，采用 SPSS13.0 统计软件进行分析。 采用单因素方差分析 (ANOVA) 对数据进行处理，两两比较采用 q 检验， P 0.05 表示有统计学意义。 结果 纳米激光粒度仪检测显示 PEI 修饰的白蛋白微泡的平均直径为 500nm 左 右。 Zeta 电位分析仪检测结果:未加 PEI 的白蛋白微泡 (AMB) 的表面电位为 (-59.28土3.4 8)mV 而加入PEI 后制得微泡的表面电位为(-44.56土0.75) mV。结合质粒 DNA 的微泡在荧光显微镜下可发出绿色荧光，未添加 PEI 的微泡 可见大量绿色荧光而未见微泡形态，未添加 DNA 未见荧光。 转染 24h 后不同实 验纽荧光和对应白光照片， 36h 后消化细胞使用流式细胞仪检测 GFP 阳性细胞 率，计算 3 次转染的平均效率，单纯 PEI 组、白蛋白十PEI 组、 PAMB 组和 Lipofectamine2000 组的平均转染效率分别为(13.75 土4.88) %、 (5.20 土 1. 15) %、 (49.17+6.75) %和 (53.72 士5.69) %。 讨论 白蛋白微泡最初作为心脏超声造影剂，后来研究发现它在超声作用下可以促 进其携带的外源基因进入靶细胞，但其转基因