口蹄疫复合多表位二价DNA疫苗的构建与其免疫原性疫研究.pdfVIP

人畜其患传染病防治研究新成果汇编 口蹄疫复合多表位二价DNA疫苗的构建 及其免疫原性疫研究 尹革芬’，金宁一2，蔫淑敏2郑敏2，马鸣潇2，张洪勇2，秦晓冰2，李萍2 30062) (1云南农业大学。云南昆明，650201；解放军基因工程重点实验室，吉林长春，1 进入二十世纪七十年代以来，随着分子生物学、遗传学及免疫学等学科的迅猛发展，口蹄疫 (Foot-and-Mouthdisease，F衄)疫苗的研究也取得了很大的进展，各种基因工程疫苗如亚单位疫苗、可 食疫苗、合成肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等不断涌现，为FMD的防 制带来新的希望。但目前所设计的基因工程疫苗存在许多问题，在许多疫苗设计的抗原成分中还含有大量 与特异性免疫反应无关的成分，如免疫抑制、增强抗体和自身免疫等免疫病理成分，这些成分很可能会成 为引起局部或全身不良反应的重要原因，致使疫苗具有潜在的危险性。而有些疫苗在设计时为了达到纯度 和安全性高的目的(如寡肽疫苗)，往往采用少数几个抗原决定簇，这样又造成抗原单一，免疫原性弱等 缺陷。 disease virus， 基于目前FMD疫苗研究的现状及发展趋势．在详尽了解口蹄疫病毒(Foot—and-Mouth FwDV)分子结构及其生物功能，分析病毒抑制宿主免疫应答的分子成分，及激活宿主免疫细胞产生保护性 础。 1 材料与方法 1．1材料 感受态菌DH5n等由本实验室保存。 NonRadioactive Assay”为 自北京大学医学部；乳酸脱氢酶检测试剂盒“CytoTox96 Cytotoxicity Promega公司产品。 由军事医学科学院惠赠。用于靶细胞的制各。 1．1．5实验动物体重18～209的雌性Balb／c小鼠购白军事医学科学院实验动物中心。 1．2方法 1．2．1辅助性Th2表位基因的设计及合成 为提高疫苗的免疫效果，根据前人的研究结果，选择效果最佳的三个Th2表位基因-其中两个来自非 381 人畜共患传染病胁治研究新成果汇编 基因序列的5’端添加了起始密码子ATG。通过基因合成方式获得该基因。 1．2．2 DNA表达质粒pVAXI～OAT的构建 将FMDV 质粒提取和纯化、PCR扩增、DNA琼脂糖凝胶电泳、酶切、连接、大肠杆菌感受态细胞制备和大肠杆菌转 化参照《分子克隆实验指南》0 i．2．3 DNA表达质粒pVAXI—OAT的鉴定 i．2．3．1间接免疫荧光鉴定 用脂质体法将核酸疫苗表达质粒转染生长于盖玻片的Hela细胞，培养72h后取出玻片，PBS洗涤， 抗体各反应1～2h，PBS洗涤3次，于荧光显微镜波长495nm处观察和拍照。 1．2．3．2Western blotting检测 用脂质体法将所构建的表达质粒转染Hela细胞，培养72h收集细胞，按本实验室已建立的方法处理 0、A型血清为第 细胞并提取蛋白，进行SDS—PAGE电泳。然后转移到硝酸维素膜上，分别以豚鼠抗EMDV 一抗体。碱性磷酸酶标记的羊抗豚鼠IgG为第二抗体，显色后检测表达的目的蛋白的反应原性。 1．2．4小鼠免疫及免疫指标检测 0型灭活苗作为对照。第三次免疫后lO天杀鼠取血清检测抗体；取脾 以PBS、pVAXI、pVAXI-OA和FMDV rdU加压筛选获得的P815