人肠道乳酸菌群的变化与分子多样性的研究.pdfVIP

人肠道乳酸菌群的变化及分子多样性的研究 胡慧敏 张 嵘 韩春茂 周宏伟 浙江大学医学院附属第二医院 人的肠道中栖息着不同的菌群，其中 99%以上的是被称为正常菌群的厌氧菌，他们大多数对人 体不致病，这类正常菌群能拮抗病原微生物，有效地防止致病菌的侵扰，正常菌群还为人体提供包 括维生素B 和维生素K 在内的多种营养，特别是维生素K，几乎全部来源于肠道菌群的合成。此外， 正常菌群能固氮，为人体合成氨基酸提供原料，更重要的是，正常菌群还能提高机体免疫力，而在 这类菌群中乳酸菌是最重要的一类菌。它们大多数寄居在结肠，对肠道健康，发展免疫系统和宿主 营养都有正面效果。过去曾有人用厌氧菌培养技术对肠道微生物的多样性进行过研究。目前国外大 多采用分子生物学技术对肠道中的厌氧菌进行研究，本实验室用 16SrRNA 基因，探讨了人肠道乳酸 菌群的分子多样性。 材料和方法 一、材料： 1.实验对象：试验组：烧伤病房送检腹泻病人标本30 份，性别不限。对照组：正常健康体检者， 随机抽取35 名，性别不限。年龄分布为：20～35 岁。 2.口服乳酸菌制剂：为Cocktail A 乳酸菌制剂（批号：00～364），由瑞典Medipharm 公司生产。 3.培养基：SS 琼脂平板、沙保弱琼脂平板、哥伦比亚血琼脂平板、厌氧血琼脂平板为本室自制。 MRS 培养基（蛋白胨 1%、酵母粉 0.5%、柠檬酸二钠 0.2%、葡萄糖 2%、牛肉膏 1%、K HPO 0.2%、乙 2 4 酸钠0.5%、MgSO .7H O0.58g/L、MnSO .4H O 0.25g/L、吐温80 1ml/L）、Wilkins-Chalgren agar： 4 2 4 2 英国OXOID 公司。日本乳酸菌培养基（牛肉膏0.5%、酵母粉0.5%、蛋白胨 1%、葡萄糖 1%、乳糖0.5%、 NaCL0.5%、琼脂 1.5%）。 4.鉴定板条：API 微生物鉴定板条（法国 Biomerieux 公司）；RapID 微生物厌氧鉴定板（美国 Remel 公司）；糖发酵等微量鉴定管（杭州天和微生物试剂厂）；微生物自动鉴定仪上机的鉴定板（法 国Biomerieux 公司和美国BD 公司）。 5.引物合成：采用 16SrRNA 的基因序列设计出具有菌株特异性的PCR 引物，用PCR 方法分别对 分离分纯并表型初步鉴定过的菌株进行鉴别。合成的 16S rRNA特殊引物和测序用引物见表 1：引物 由上海博亚生物技术有限公司合成。 表 1 乳酸菌引物序列 引物名称 引物序列 16S通用引物 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′（上游） 5′-ACGGNTACCTTGTTACGACTT-3′（下游） N 表示A，T，C，G 中任何一种。 测序引物 1 5′-CCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′（上游） 5′-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3′（下游） 测序引物2 5′-GCCTTCGATACTGGACATCTTGA-3′（上游） 5′-AATTAAACCACATGCTCC ACCG-3′（下游） ～667～ 6.试剂：细菌基因组DNA 小量制备试剂盒、切胶回收试剂盒（杭州V-gene 生化技术有限公司）； Premix Taq 酶（TaKaRa 宝生物工程大连有限公司）。 7.仪器：VITEK-AMS 全自动微生物鉴定仪（法国Biomerieux 公司）；VITEK2 全自动微生物鉴定 仪（法国Biomerieux 公司）；Phenix