朊蛋白在奶牛生殖系统特异性表达研究.pdfVIP

朊蛋白在奶牛生殖系统特异性表达的研究‘ 张太翔赵德明。 (中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室北京100094) 摘要：利用实时荧光定量RT--PCR技术，采用GAPDH基因做内参照，对奶牛生殖系统的12个 不同部位组织提取总RNA，进行PrP基因表达的定量研究。结果发现，雌雄奶牛的生殖系统各 部分组织都有PrP基因表达，其中雌性奶牛的卵巢、子宫、子宫阜呈现高的表达量，雄性奶 牛的睾丸、附睾呈现高的表达量。本研究的结果对于探讨朊蛋白的基本功能和生殖系统在传 染性海绵状病理发生中的作用，提供了基础数据。 关键词：动物传染性海绵状脑病，PrP基因，实时荧光定量RT-PCR 传染性海绵状脑病(TSEs)是一类动物和人的神经退化性疾病，包括羊瘙痒病(Scrapie)、 牛海绵状脑病(BSE)、鹿的慢性消耗性疾病(CwD)，水貂海绵状脑病(MSE)，猫的疯猫病 TSE发生和发展的关键，错误折叠的PrP。聚合形成淀粉样纤维和成淀粉样斑块，导致神经 系统内实质细胞功能的丧失，在形态学上呈现典型的海绵样变化[3，7]。 虽然朊蛋白可以通过口服，接触，静脉注射，脑内注射等方式感染实验动物[3，5，6]， 但到目前为止还没有朊蛋白垂直感染的报道，人们迫切需要了解朊蛋白垂直传播的可能性。 生殖系统与垂直传播有很大的关系，如果感染TSE动物的生殖系统有PrP．。的存在，PrP”就 可能通过交配传播给健康的个体，母畜就可能直接传给子宫的胎儿，使之携带PrP”，使TSE 形成垂直传播。为了研究生殖系统在BSE传播中的作用以及Pr，在正常奶牛生殖系统的分 布，我们采用正常的奶牛生殖系统，用GAPDH基因做内参照的相对定量RT-PCR方法[8，9]， 构建标准重组质粒制备标准曲线，对雌雄奶牛生殖系统的12个不同部位组织提取总RNA。 反转录后进行PrP基因表达的定量[10，11]。为阐释 PrP基因在奶牛生殖系统的表达和正常的生理功能以及生殖系统在TSE垂直传播中的地位和 作用的分子机理奠定基础。 l材料和方法 1．1实验动物 试验动物为健康奶牛。采集的母畜的生殖器官包括：卵巢、输卵管、子宫、子宫阜、阴道； 公畜的生殖器官包括：睾丸、附睾、输精管、精囊腺、前列腺、尿道球腺、阴茎。E．coliDH。 。株由本实验室保存。TRIZOLRNA提取试剂盒(Gibco公司)、dN TPs(TaKaRa公司)、 DNA聚合酶(Ta Taq 司)、RNAsEOUT GreenIPCRKit(FINNZYMES Ribonuclease(Promega公司)、SYBR I(Ta 公司)、ECOR KaRa公司)、质粒快速提取试剂盒(博大泰克公司)、PGEM-TEasy Vector GelExtraction Systems(Promega公司)、E．Z．N．AKit(Promega公司)、 PCR仪(PTC2150型。MJResearch公司)、实时荧光定量PCR仪(OPTICON2型，MJ Research公司)。 1l2组织内总RNA的提取 +核酸提取过程中所用试剂均用0．1％DEPC处理水配制，塑料制品均用0．I％DEPC水37 ℃浸泡2h，．高压灭活DEPC毒性。取液氮保存组织置于含液氮的组织研钵中迅速研磨成粉 Bio-tek公司)的 末状，取50～lOOmg的组织转移入含有1n儿RNA．SolV试剂(Omega p min，120009离心20min：取约80％上层水相移入一新的Eppendorf管中，加约500L异 丙醇(4℃保存)。置冰上10min，120009离心lOmin，弃上清；加入imL 75％乙醇(4℃保 min；弃乙醇，室温干燥10～20min，加入30～50pL 存)，75009离心5