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实验八植物微核检测技术 哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院 遗传教研室 2010年3月 背景知识——毒理遗传学： 又称遗传毒理学，用遗传学方法研究环境因素对遗传物质的损害及其毒理效应的遗传学分支学科。 环境中可产生诱变的因素： 物理诱变：如紫外线，X-射线，γ-射线，快中子，激光，微波，离子束等。如空间诱变。 化学诱变：如烷化剂、碱基类似物、氯化锂、亚硝基化合物、叠氮化物、抗生素和吖啶等嵌入染料。 环境因素造成的遗传毒理效应：“三致效应” 突变形成：诱发生殖细胞的基因突变和染色体畸变，造成子代遗传性疾病发生频率增加; 癌形成：诱发体细胞基因突变或在亲代遗传突变形成的背景上诱发体细胞突变引起的体细胞恶性转化为癌细胞; 致畸效应：作用于发育中的胚胎细胞干扰基因的正常作用,影响胚胎细胞分化和器官系统的发育导致畸胎的发生。 肿瘤的发生和类型 遗传毒理评价所用的材料： 植物、昆虫、水生动物等，如紫露草花序、蚕豆根尖、鱼红细胞遗传毒性试验。 动物细胞：小鼠骨髓细胞、外周血淋巴细胞等。 人类细胞：口腔粘膜细胞、鼻腔粘膜细胞、头皮毛囊细胞、痰液细胞等。 “三致效应”的检测方法： 早期的方法：用待测化学物质喂饲、注射动物或涂布在动物皮肤上，观查动物是否因此而患肿瘤或出现畸胎等。 现在一般都采用细菌、离体培养的哺乳动物和人类体细胞、植物为测试对象，主要的方法有： ①以基因突变为指标的检测法 ②以染色体为指标的方法 以染色体为指标的“三致效应”的检测方法： 经典的染色体畸变分析方法； 姐妹染色单体互换测试法； 微核测试法。 （1）断片 （2）双着丝点 （3）环 微 核 微核测试法： （micronucleus test, MNT） 20世纪70年代初由Matter和Schmid首先建立了一种简便、快速、评价客观地检测来自环境中的各种理化及生物因子对机体产生潜在的遗传损伤方法，即用哺乳动物骨髓嗜多染红细胞（polychromatic erythrocyte, PCE）微核率的实验方法。 微核测试法的应用： 辐射损伤； 辐射防护； 化学诱变剂； 食品添加剂； 新药试验； 染色体遗传疾病； 癌症前期诊断等。 实验目的： 通过植物根尖微核试验，掌握微核的制片技术、识别及计数方法。 了解评价理化因子对机体遗传损伤的快速筛选方法。 实验原理： 微核（micronucleus, MN）是真核生物细胞中的一种异常结构。由于细胞经辐射或化学药物等作用使染色体受到损伤，在有丝分裂中、后期细胞中形成丧失着丝粒的染色体单体或染色体断片，这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即微核。游离于细胞质中形成的次核。在间期细胞中，常常见到比普通细胞核小很多的一个或几个圆形结构，其直径大约相当于细胞直径的1/20~1/5。 微核率与用药剂量或辐射积累效应呈正相关。 实验材料： 毛葱（Allium fistulosum）根尖。 实验器材： 显微镜，冰箱，水浴锅，分析天平，剪刀，镊子，刀片，载玻片，盖玻片，滤纸，量筒，滴瓶，酒精灯，指管等。 试剂 环磷酰胺（CP） 卡诺氏（Carnoy‘s）固定液 希夫（Schiff‘s）试剂 45%醋酸 1 mol/L盐酸 实验步骤： 根尖的培养 环磷酰胺处理 固定 解离 染色 压片 镜检及观察 实验材料准备 临时装片制片 细胞学鉴定 诱变处理 实验材料准备 —— 诱变处理 毛葱沙培生根，室温下2~3天即长出0.5 ~ 1cm长的根； 置于100mg/L、150mg/L环磷酰胺溶液中处理24小时； 从药液中取出，水洗后清水培养22~24小时； 水洗后用Carnoy’s固定液固定24小时，水洗，转入70%乙醇中保存。 临时装片制片 —— 细胞学鉴定 解离：取70%乙醇中保存的根尖水洗两次，用1 mol/L HCl 在60℃处理根尖8~10min后，水洗3~4次，每次5min。 染色：根尖在有盖的小瓶中加入希夫（Schiff ）试剂染色30min~2h。 压片：在干净的载玻片上切下根尖分生区，滴一滴45%醋酸，加盖玻片，用滤纸吸净多余的液体，一手压住盖玻片一角，另一手持竹针轻敲盖玻片至组织呈云雾状。将载玻片在酒精灯上轻烤，在盖玻片上覆滤纸条，用拇指垂直按压制片。 镜检及观察，检查400个细胞/片。 结果及分析： 细胞学观察： 在细胞分裂间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小在主核的1/3以下，折光率及细胞化学反应性质和主核一样。 毛葱根尖微核 2. 微核率计算 微核率（MCN%o）= ×1000%o 微核检测记录表 片 号 细胞数 微核数 微核千分率 第1片 第2片 第3片