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PRRSV M 蛋白细胞系的培育及其在CTL 检测 方法中的应用1 蒋文明，姜平，李玉峰 南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，南京(210095) E-mail ：civcul@163.com 摘 要：目的探讨PRRSV M 基因在哺乳动物细胞NIH/3T3 细胞中的表达，建立一种非放 射性、简便易行的检测特异性细胞毒 T 淋巴细胞（CTL ）的方法。方法应用RT-PCR 扩增 得到M 基因并克隆入真核表达载体pcDNA3 ，构建成重组表达载体pcDNA3-M ；将重组质 粒转染至NIH/3T3 细胞，G418 筛选克隆；IFA 检测M 蛋白在转基因NIH/3T3 细胞中的表达。 用表达M 蛋白的重组腺病毒rAd-M 免疫小鼠，用表达M 蛋白的NIH/3T3 细胞和乳酸脱氢 酶法检测PRRSV 特异性CTL 的杀伤效应。 结果 获得有G418 抗性的NIH/3T3/M 细胞克 隆；IFA 检测到有PRRSV M 蛋白表达。重组腺病毒rAd-M 免疫组可以诱发CTL 应答，并 明显高于 wtAd 和 PBS 对照组。 结论 培育成功一株能表达 PRRSV M 蛋白的细胞株 NIH/3T3/M ，可作为PRRSV CTL 检测方法中的靶细胞，证明PRRSV M 基因能够诱发特异 性的细胞免疫。 关键词：PRRSV ，M ，真核表达，CTL ，细胞免疫 中图分类号：R392-33 文献表识码：A 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS ）是近年来爆发的猪的一种危害严重的传染病，主要引起繁 殖母猪流产和新生仔猪呼吸道疾病[1,2] 。该病的病原PRRSV 属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒 属，是单股正链RNA 病毒。基因组大小为 15kb 左右，含有9 个开放阅读框[3] 。由ORF5、6 和7 编码的GP5、M 和N 蛋白是病毒的主要结构蛋白。其中M 蛋白是病毒的基质蛋白，大 小为18-19 kD，能诱导机体产生细胞免疫应答和中和抗体[4] 。M 蛋白可以通过二硫键与GP5 蛋白形成异源二聚体，在免疫应答中起重要作用[5] 。以前有不少学者认为体液免疫在防制 [6，7] [8] PRRSV 方面发挥主要作用 ，但是近来研究表明细胞免疫可能起更重要的作用 。传统测 51 51 定细胞毒性T 淋巴细胞常用 Cr 释放法，此法比较灵敏，测定结果较精确，但是 Cr 是一 种放射性同位素，半衰期短，对人体有一定的危害性，而且价格较昂贵，测定仪器要求严格 等，不利于广泛应用。本研究的目的在于寻找一种非同位素、简便易行的方法检测 PRRSV 特异性细胞毒性T 淋巴细胞（CTL ）的杀伤水平，为PRRSV 免疫奠定基础。 1 材料与方法 1.1. 细胞与病毒 NIH/3T3 细胞由本室保存，重组腺病毒rAd-M 、wtAd 由本实验室构建 保存。 1.2. 主要试剂 真核表达载体pcDNA3 、QIAGEN Plasmid Mini Kit、TRIzol （购自Invitrogen 公司）。限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶、DNA Marker 、DNA 胶回收试剂 盒（购自TaKaRa 公司）。M-MLV 、TransFastTM Transfection Reagent （购自Promega 公司）， 鼠抗PRRSV M 蛋白单克隆抗体（由本实验室制备保存），FITC-羊抗鼠IgG （购自博士德公 司）。 1.3. 稳定表达M 蛋白细胞系的培育 1本课题得到教育部博士点基金项目（2003030712 ），新世纪优秀人才支持计划（NCET-04-0502 ）和国家自 然科学基金30270990 ）的资助。 -1-