实时定量PCR对猪圆环病毒2型感染猪体内病毒分布规律研究.pdfVIP

病毒病 实时定量PCR对猪圆环病毒2型感染猪体内病毒分布规律的研究 危艳武，刘长明‘，袁婧，黄立平，张朝霞 (中国农业科擘院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，猪传染病研究室．黑龙江哈尔滨150001) 摘要根据发表的猪圆环病毒2型(PCV2)OI玎2基因序列设计了一对特异引物，并以克隆重组质粒作为阳性标 人工感染猪心。肝．脾、肺、肾、腹股沟淋巴结等组织中病毒核酸载量检测结果表明，多种脏器均可检测到病毒， 但以腹股沟淋巴结、扁桃体和脾脏中病毒含量较高，表明病毒主要在免疫器官增殖，导致淋巴细胞耗损．用实时定 量PCR对来自国内不同地区的28份临床发病猪痛料进行病毒DNA定量检测，有半数以上病例病毒载量持在109—10 拷贝，g数量级．实时定量PCR可用于PcV2核酸定量检测，为该病毒体内外定量检测提供了一种技术手段． 关键词猪圆环病毒2型．实时定量PCR，病毒体内分布规律 circovirus 猪圆环病毒2型(Porcine type wasting multisystemic 苍白、淋巴结肿大、肾脏灰白水肿为主要特征。本病于1991年在加拿大西部首次被发现，现己证实 呈世界性流行，我国一些猪场普遍存在本病，给养猪业造成巨大经济损失。该病毒粒子直径约17nm， 无囊膜，二十面体对称，基因组由1767或1768个碱基形成的单股闭合环状DNA构成，以滚环方式复 制。由于PCV2体外感染不产生细胞病变，给病毒含量测定带来一定困难。我们先前报道了一种过氧 量的方法，但它不能用于感染动物体内病毒核酸载量测定。有研究报告证实，临床上表现出PMWS 症状与感染动物体内PCV2核酸载量呈正相关，病毒载量越大，病情越严重。因此，准确测定PCV2 感染动物体内病毒含量及分布特点，对该病毒的致病性研究具有重要价值。鉴于实时定量PCR (Real．time PCR)技术是近几年发展起来的新技术，它既保持了PCR技术的灵敏性和快 quantitative 速特点，又克服了常规PCR技术中存在的假阳性和不能进行准确定量的缺点，在多种动物病毒疾病 Green 研究中得到广泛应用。本研究采用SYBR I嵌合荧光法建立了一种PCV2实时定量PCR检测技 术，用于感染动物体内病毒核酸分布及含量测定，旨在为该病毒致病性、诊断及疫苗免疫评价提供 一种技术手段。 l材料与方法 1．1病毒、血清和细胞 采用的PCV2／LG株和PCV2／PE株均为本室分离培育及采用感染性分子克隆构建；其它相关几种 PremixEx 司，SYBR Taq试剂盒购自大连宝生物公司。 1．2引物设计与PCR扩增 ， 引 584： PCV2．FI321 ： 5’．TAGGTGAGGGCTGTGGCCTT．3’下 游 物 为PCV2．RI Ex 30s，55℃30s， 用TaKaRaTaq试剂盒进行PCR扩增。常规PCR反应条件：预变性94C2min，【94。C 72C 10rain。用l％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。 45s]x35个循环，延伸反应72。C 1．3标准DNA模板的制备 ·项目来源：国家‘948”计划(2006-7_,6)／国家科技支撑计划项目(2006BAD06A07)资助 作者简介：危艳武(1975一)，男，吉林农安人，助理研究员，主要从事猪病毒学研究． ‘通讯作者：|cm@hvri．扯．cn 448 第三届猪病防控学术研讨会会议论文集 由本实验室构建。经鉴定的重组质粒用于制备实时 含PCV2全长基因组重组质粒(pUC—PCV2) 定量PCR标准品，用紫外法测定质粒DNA浓度，小量分装，置-20℃备用。 1．4实时定量PCR操作程序 PremixEx 采用SYBR Taq试剂盒进行实时定量PCR试验。以重组质粒标准品为模