沼泽型水牛和河流型水牛亚种间体细胞核移植的研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十四艋学术研讨会论文集 沼泽型水牛与河流型水牛亚种间体细胞核移植的研究 杨春艳t。杨炳壮-，李日聪·。陈明棠·，覃广胜-，张秀芳t，庞春英1，李嫜1， 黄右军-，陈大元2石莉红2’粱贤威t‘ 1．中国农业科学院广西水牛研究所广西南宁530001；2．中国科学院动物研究所，北京，100080 摘要屠宰场收集沼泽型水牛卵巢抽取cOcs，体外成熟培养20一22h后借助纺锤体成像系统去核作为受体细胞，取出生6天的河 流型摩拉水牛耳部成纤维细胞培养并传至第4代，于一196℃液氮中保存，解冻后直接作为供体细胞，采用卵周隙注射法组建重构 果表明重构胚的电融合卒为64．33％(889／1 382)。 将30枚新鲜核移植囊胚移植给13头自然发情或经同期发情的受体母牛，每头次移植鲜胚2—3枚，胚胎移植后30天经妊娠检 查，确诊4头受孕，受胎率为30．77％(4／13)．其中三头受体牛分别在妊娠的第65、75和90天流产，所流出的胎儿形态正常。一头 移入三枚新鲜胚胎的杂交母水牛(摩拉水牛x沼泽型水牛)在妊娠的第335天自然顺利产下一雌性水牛犊，牛犊初生重39kg。至 目前为止，克隆牛犊生长发育良好． 关奠词沼泽型水牛，河流型水牛，亚种，体细胞核移植 体细胞核移植是一种近年发展起来且较具生产潜力的繁殖新技术，在家畜改良和育种工作中有广阔的应用前 景，成为当今生物技术研究的热门领域。体细胞核移植技术使加快家畜遗传改良，迅速扩大良种繁殖成为可能。继第 一头体细胞克隆羊川出生后，核移植技术在之后的数年里发展极为迅速，现今已成功采用多种类型的体细胞克隆出 了奶牛闭、小鼠例、山羊【4I、猪同、兔【6J、猫【刁、老鼠嘲、马I研、骡㈣、狗…】、雪貂【121、绵羊113】等哺乳动物。而水牛体细胞核移植研究 牛在第60天通过超声波诊断确定妊娠，但妊娠均未超过90天。直到2007年，DeshuIlShi等旧报道将42枚由水牛颗 粒细胞和胎儿纤维细胞克隆得到的囊胚移植入21头受体水牛，4头妊娠，其中一头在孕期300天流产出两头雌性牛 犊，另外三头在第338．349天产出三头雌性克隆水牛犊。但其中两头牛犊分别在出生后20分钟和第12天死亡，仅存 活一头，成为世界j二唯一由胎儿成纤维细胞克隆得到的成活沼泽型水牛犊。而未见有关细胞染色体核型不同的沼泽 型水牛和河流型水牛亚种问核移植的研究报道。 ． 沼泽型水牛和河流型水牛虽同属于牛属但为品种不同的两个亚种，前者的细胞染色体核型为2n=48，其体型 小，以役用为主，乳肉生产性能低；后者的细胞染色体核型为2n=50，体型大，奶用型品种，产奶性能好。中国水牛多 属沼泽型，分布广泛，水牛数量居世界第三位。本研究旨利用沼泽型水牛的卵母细胞为受体细胞，河流型水牛的体细 胞为供体细胞，探讨两个亚种问核移植的可能性，以期改良和提高沼泽型水牛的生产性能，加快良种水牛扩繁速度， 促进水牛奶业快速发展。 l材料与方法 液体均购自sigrna—Al删ch公司。 1．1卵母细胞的体外成熟 屠宰场采集本地水牛卵巢，在30．35℃生理盐水中保存，3h之内送入实验室。卵巢用生理盐水清洗三遍后， FSH+ 10m咖lLH+10％FBS+0．5mM半胱氨酸+1吲mlE2+5011∥ml 下培养20．22h。 1．2耳部成纤维细胞的准备 将出生6天的摩拉牛犊的耳部用肥皂和温水反复清洗，双面刀片剃毛，而后用碘酒棉球涂擦三次，75％酒精脱 的生理盐水中带回实验室。 在超净台中，将大块组织于DPBS中洗5．6次，去除周边组织，再次清洗后，去除软骨，剪碎并放入培养皿中，加 13核移植供体细胞的准备 体细胞培养代至第四代后，用0．25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，加入DMEM，1500f·mill．1离心5m访，重复两遍， 197． 【{J同齑牧兽医学会动物繁殖学分会第t‘四届学术研讨会论文集 而后投入液氮中保存。核移植操