从鸭胚成纤维细胞中分离纯化鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株方法地研究.pdfVIP

第六次全国会员代表大会暨第1l攻学术研讨会 从鸭胚成纤维细胞中分离纯化鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株 方法的研究 郭宇飞，程安春，汪铭书，贾仁勇，文明 (动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川农业大学动物科技学院禽病防治研究中心，四川雅安 625014) 的研究。结果表明：首先采用标称孔径为0．22¨m和标称截留分子量为1000K超滤膜依次对病毒液依次进 蔗糖密度梯度离心的方法可以提纯得到多量的DEV-CHv完整病毒粒子。 关键词：鸭病毒性肠炎病毒；鸭胚成纤维细胞：密度梯度离心；纯化 1材料方法 1．1仪器和试剂：切向超滤系统(Millipore LabscaleTFF)；切向超滤膜(Millipore 称孔径O．22 PVDF，50 Pellicon p．m，micron XL标称截留分子量1000K． cm2)：切向超滤膜(Millipore cm2)；蛋白质低压纯化系统(Bio．Rad 4B琼脂糖凝胶 polyethersulfone，50 BiologicLP)；Sepharose Coulter (Amersham．Pharmzcia公司)；超速离心机(Beckman Optima Coulter 21R)；磷钨酸(中国医药上海化学试剂公司，分析纯)：透射电子显微镜(日立公司， Allegra H．600A-2型)。 1．2 6．8)：取l ml超纯水中；用l 2％磷钨酸(pH g磷钨酸溶解于40 6．8；定容至50m1，用O．22 lam滤膜过滤除颗粒；分装后于4C密闭保存。 113实验方法：将接种DEV-CHv后细胞病变程度达80％的DEF细胞收获(1000ml细胞悬液)，用加 有细石英砂的玻璃匀浆器在无菌操作条件下充分研磨细胞悬液；将细胞悬液于4℃温度下以9000r／min离 心45 O．22岬的超滤膜进行超滤，将收集到的滤过液(960m1)使用标称截留分子量为1000K超滤膜进行超滤， mol／L， 收集截留液(30 4B琼脂糖凝胶在EconoColumn中的装柱．然后用PBS(O．01 m1)；进行Sepharose pH7．4)进行平衡，流速为0．6ml／min，平衡时间为36h，此时仪器的Uv吸收值和电导检测曲线为平直： 上样和收集：上样量为4ml，用PBS(O．Ol ml／min，分别收集洗脱 mol／L．pH7．4)进行洗脱。流速为0．6 r／min离心2 出来的紫外吸收峰；将洗脱出来的紫外吸收峰以36，000 h，沉淀用PBS进行悬浮后叠加到从 r／rain 离心2h，分别吸取离心形成的条带，以36。000r／min离心2h进行脱糖处理；将沉淀用500PBS进行悬 p,I 浮后于一20℃保存备用；将病毒悬液滴加到覆盖有Formvar膜的