骨髓动员治疗糖尿病大鼠后肢缺血与研究.pdf

中 文 摘 要 骨髓动员治疗糖尿病大鼠后肢缺血的研究 摘 要 目的：糖尿病能损害血管内皮细胞从而引起微血管病变闭塞, 糖尿病 动脉硬化闭塞症的发病率是非糖尿病的11倍, 且周围动脉硬化发展快, 程 度重, 范围广。由于糖尿病主要引起下肢远端微小血管的病变闭塞, 常失 去手术治疗机会, 易引起下肢远端缺血而致坏疽。 “治疗性的血管形成” 目前已被广泛接受, 已有报道采用成纤维细胞 生长因子（FGF ）或血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因直接注射治疗糖 尿病肢体缺血或者移植自体骨髓干细胞治疗糖尿病肢体缺血, 前者由于 基因治疗的安全性而受到质疑, 而后者对于单纯移植CD34+细胞还是多 种干细胞一起移植仍在争论中。本研究采用自体骨髓动员以观察单纯骨髓 动员对糖尿病大鼠肢体缺血的作用。 本研究旨在：1 通过动物实验复制动物（SD 大鼠）糖尿病模型及后 肢缺血模型，通过毛细血管密度的改变观察骨髓动员治疗糖尿病大鼠肢体 缺血的疗效。2 通过骨髓动员前后血CD34+细胞和白细胞的含量变化，观 察大鼠肢体急性缺血后是否存在骨髓干细胞动员状态。3 通过内皮功能动 态的监测，观察骨髓动员对糖尿病大鼠全身血管病变的影响。 方法：实验对象SD大鼠25 只，雄性，8周龄，体重180-250克之间， 制备糖尿病大鼠后肢缺血模型，随机分为2组，其中15只进行骨髓动员（A 组），其余10只不进行骨髓动员，为空白对照组(B组) 。骨髓动员后及动员 后3 天从A 、B 两组大鼠内眦静脉取血用流式细胞计数仪检测WBC 和 CD34+细胞。骨髓动员前及动员后第2 、4周于内眦静脉取血检测ET和NO 水平，动员后第4周取双后肢肌肉做病理检查，检测毛细血管密度观察骨 髓动员治疗糖尿病大鼠肢体缺血的疗效。 1 糖尿病大鼠模型的制备 大鼠禁食 12 小时后，按65mg/kg 剂量一次性腹腔注射 1%链脲佐菌 素(STZ)1.5-2ml,给药 72 小时后连续两次通过尾静脉采血，检测空腹血糖 ＞16.65mmol/L 作为糖尿病大鼠模型。 2 糖尿病大鼠后肢血管病变模型的制备 1 中 文 摘 要 麻醉大鼠后，取其双侧腹股沟韧带至膝关节上下各行一纵行缺口，分 离、结扎、离断股动脉及其分支。观察3 天，手术后肢逐渐萎缩，活动力 下降，无坏疽，为糖尿病大鼠后肢血管病变模型的制备成功。 3 骨髓动员 糖尿病后肢缺血模型制备成功后，A 组皮下注射粒细胞集落刺激因子 -1 -1 （G-CSF ，150ug.kg .d ）,同时B 组每天皮下注射生理盐水 1ml/d,连续3 天。继续饲养大鼠4 周。 4 外周血WBC和CD34+细胞计数 动脉离断术后当天从A 、B两组大鼠内眦静脉取血0.5ml, 同法骨髓动员 3天后以上大鼠各取血0.5ml, 采用Ficoll 液离心制备外周血单个核细胞, FITC- CD34+单抗标记后用流式细胞计数仪检测WBC和CD34+细胞。 5 血管内皮功能生化指标的测定 血浆一氧化氮（NO ）采用硝酸还原酶法测定，单位：umol/L 。血浆 内皮素（ET ）采用放射免疫分析法测定，单位：pg/ml 。 6 注射部位肌肉中毛细血管密度的测定 常规方法制备大鼠肌肉光镜组织切片，行苏木素-伊红（HE ）染色,免 疫组织化学法行CD34 染色进行毛细血管密度的测定。 7 统计学处理 所有数据用SPSS13.0软件处理，计量资料以均数±标准差表示，组间 差异用两样本均数的t检验进行比较，实验前后用配对资料t检验进行比较， 两组以上比较采用单因素方差分析。显著性用P值表示，P ＜0.05为差异有 显著性，P ＜0.01为差异有极显著性。 结果： 1 实验动物