固定化细胞酶法拆分DL-精氨酸的研究.pdfVIP

固定化细胞酶法拆分DL．精氨酸研究 刘均忠 焦庆才蒋丽丽 沈俞刘茜 (南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室，江苏南京210093) 摘要：以DL一精氨酸为原料，利用固定化细胞酶法拆分DL-精氨酸，并对拆分条件 进行了摸索。结果表明：最适反应温度55℃，最适pH6．0，c(DL-精氨酸)=0．3mol／L， 保留75％的酶活力。产物经分离纯化，D一精氨酸的收率达89．2％，[Q]哿=一26．9 (2％，5mol／L盐酸)。 关键词：DL一精氨酸：精氨酸脱亚氨酶；粪肠球菌；固定化细胞；光学拆分 剂和医药中间体【I屯J。D．Arg作为多肽的组成氨基酸具有重要的生理作用，可以抑 制癌症扩散，治疗生长激素过多释放造成的紊乱【3】，抑制DNA合成和抑制前列腺 癌细胞增殖H】。此外，D．Arg还具有抗高血压的功能【5】。 目前D．Arg的制备方法主要有：(1)化学法：(2)生物转化法。化学法是指 DL．Arg先与光学活性拆分剂反应生成具有旋光性的氨基酸衍生物，然后再水解， 调节pH至氨基酸等电点，即可析出晶体。化学拆分法通常工艺路线复杂，都要先 转化成氨基酸衍生物，故步骤多、收率低，且存在拆分剂的选择、 回收问题16J。生物转化法是以微生物细胞或从微生物中提取的酶作为生物催化剂， 利用精氨酸脱亚胺酶的立体选择性拆分得D．Arg和另一副产物，反应条件温和、 不产生有毒物质，转化体系中杂质较少，提取工艺简单，但游离细胞或酶在转化 过程中流失严重，细胞或酶重复利用率不耐7。引。 固定化细胞或酶能有效提高酶的稳定性，提高重复利用批次。由于固定化细 胞既有效地利用了游离细胞的完整酶系统和细胞膜的选择通透性，又进一步利用 了酶的固定化技术，制备又比较容易，其实际成功应用的实例超过了固定化酶。 作者利用固定化精氨酸脱亚胺酶细胞的方法来拆分DL．Arg，确定了拆分的最 佳工艺条件，有效提高了酶的稳定性和重复使用性，大大降低了生产成本，有较 好的工业化应用前景。 l反应体系温度对酶活性的影响 转化温度是由菌体酶活、酶的热稳定性及其转化效率决定的。为使固定化细 胞达到最高酶活力，考察了不同温度对酶活力的影响，以最高酶活力为100％，作 相对酶活力曲线图。固定化细胞反应的最适温度是67℃左右，低于67℃酶活随温 度升高而相应增加，高于67℃由于酶的热变性而部分失活。综合考虑各方面的因 素，控制反应体系的温度为55℃。 2反应体系pH值对酶活性的影响 酶促反应需要在适当的pH环境下进行，作者研究了固定化细胞在不同起始 pH转化液中的活力变化，起始pH值介于5．O～6．5时固定化细胞酶活相对较高， 在pH6．0时酶活达到最高，过高或过低pH值可能影响酶蛋白分子的构象。 3底物浓度对拆分率的影响 底物浓度会影响拆分反应的拆分率和拆分时间。当底物浓度不大于0．3mol／L 137 mol／L 时，反应12h，拆分率都能达到98％以上。而当底物浓度为0．4mol／L和0．5 时，反应12h，拆分率分别为89％和82％，当底物浓度为0．6mol／L时，反应20h， 拆分率仅为87％。 4菌体用量对拆分率的影响 固定化细胞过程中，菌体用量与固定化材料的体积之『白J存有最佳比例。对一 定体积的固定化材料而言，菌体量过少，则比酶活低、拆分效率差；菌体量过多， 由于固定化材料包埋能力有限，容易发生菌体泄漏，从而降低酶活。 当菌体浓度在209／L,～509／L时有较高的酶活，其中菌体浓度309／L时酶活最 高，同时拆分率也达到最高。 5酶促反应进程 0．3mol／L 在100mL 70r／min DL．Arg、55℃、pH6．0、固定化菌体浓度309／L、l 的拆分体系中，分别于不同时间取样检测拆分体系中L．瓜氨酸的含量。分析表明 含量增加不明显，拆分率达到98．39％。因此，酶促反应10h即可停止。 6固定化细胞稳定性研究 前4批反应酶活先上升后下降，先上升可能是固定化细胞适应了转化体系， 适当浓度的底物激活了酶的转化能力，后来又持续