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家蚕蛋白质组学研究： LPS注射后的免疫反应* 王永强1 张平波2藤井博2伴野丰2山本辛治2麻生阳一2 (1浙江省农科院蚕桑研究所，杭州310021； 2日本九州大学家蚕遗传子资源研究中心，福冈812—8581) 摘要：以家蚕为模式生物，通过注射LPS，运用双向电泳技术，分析了不同组织器官 (中肠，脂肪体和体液)的蛋白质组变化，发现了LPS注射后诱导的5个免疫蛋白，Fb 检索进行了鉴定，其中H一4为家蚕上己发现的免疫蛋白一attacin，其余的可能为新 的免疫蛋白类型：用PDQuest6．2双向电泳分析软件，对LPS注射后不同时间的蛋白 质浓度进行了定量分析，结果表明不同免疫蛋白有着不同的抗茵作用方式。 关键词：蛋白质组，免疫反应，LPS，家蚕 针对外界微生物的感染，昆虫具有自身的防御体系。通过体液反应产生免疫蛋白是重要的 不同类型的免疫蛋白存在【4]。家蚕属鳞翅目昆虫，已发现至少有4种类型的免疫蛋白存在，包 织器官的蛋白质变化信息还不充分；而且对昆虫免疫蛋白的研究方法，都局限于DD—PCR的 方法，在基因水平上进行研究“”llJo 随着生物质谱技术和DNA数据库的不断完善，诞生了蛋白质组学，蛋白质组指的是特定 组织或细胞内的所有蛋白质总和。目前，蛋白质组学已成为后基因组时代的主要研究方向，为 在蛋白质水平上，大规模分离、鉴定特定蛋白质或研究基因功能提供了有效的分析手 段Int3l。 本研究以家蚕为模式生物，通过注射Ⅱ)S(大肠杆菌细胞壁的主要成分)，运用双向电泳技 术[14“】(等电点聚焦和SDS凝胶电泳)，对不同组织器官(中肠．脂肪体和体液)的蛋白质组变 化进行了研究，并用生物质谱技术和生物信息检索对LPS所诱导的蛋白质进行了鉴定。 作者简介：王木强(1970．12)．男，助理研究员．博士，芏要从事遗传育种及蛋白质研究。 ·奉研究获2D呛一2003教育帮冒学基金硬且赍助。 △获一等奖 1棱聃|责法 1．1蛋白质分析样本 以日本九州大学保存的家蚕品种pso为材料，5龄3日幼虫每头注射￡焉20唱，注射后0 h，24 h，媳h。分别取出中肠，脂肪体和血液，并提取相应的蛋白质分析样本，未处理的作为对 照；测定各样本的蛋白质浓度，保存于一80℃中。 1．2双向电泳 Phammcia 等电聚集：用Amersham 胶条，进行一次电泳。各样本的蛋白质上样量为150 h后，在100 ug。电泳程序包括，膨润12 V，6000V和8000 h，0．5h,0．5 V，200V，500V，1000V，2000V，4000 V下的电泳时间分别为0．5 h，0．5h，0．5h。0．5h，1h，10h。用等电点lⅫkr确定各蛋白质的等电点。 流条件下进行二次电泳。用分子量mrker确定各蛋白质的分子量。 蛋白质染色和检出：用与质谱分析相适应的银染方法[16]进行蛋白质的染色．通过u丐注 射区和对照区蛋白质双向电泳图谱的差异比较。检出啪诱导的免疫蛋白质点。 1．3蛋白质定量分析 用PDOIlI∞晒．2双向电泳分析软件，对u)s诱导的蛋白质在不同时间的浓度进行定量分 析。 1．4肽提取 通过脱色㈨和胰蛋白酶胶内消化【1l】的方法，提取LPS诱导的蛋白质的肽片断。 1．5生物质谱分析和同源性检索 MALDI—TOF Biosystem Voyager—DETM质谱仪对LPS诱导的蛋白质，进行肽 用Perseptive 指纹图谱分析。并用In—house和家蚕EST数据库(包括32，000条数据)进行同源性鉴定。 2试验结果 2．I不同组织器官的双向电泳结果 2．I．1中肠 h的中肠双向电泳结果见图I。不同时闻LPS注射区与 LFS注射区与对照区0h，24h，48 对照区双向电泳图谱差异比较．未