人白介素18(IL-18)插入突变体抗血管新生作用的探究.pdfVIP

人白介素18(IL-18)插入突变体抗血管新生作用的研究 卢忠民，赵宝昌· 16027) (大连医科大学生物化学和分子生物学教研室，辽宁大连l [摘I【】目的：构建IL一18的定点突变体，并研究其对血管新生的抑制作用．方法：利用基因重叠延伸剪 pPIC9K，并在酵母川曲妇厅storisGSll5中得到高效表达。鲒果：IL-I IFN-Y能力外．对ECV304细胞的增殖(IC50-7．80 IL—18相比，IL-I$-RGD增加了抗血管生成作用，从而增强其抗肿瘤能力． [关麓词】IL-18；RGD模体；毕赤酵母；ECV304细胞 没润及与Fn的结合具有明显的抑制作用pJ。鉴于IL．18本身具有抗肿瘤方面的功能¨“，故我们在其分 细胞的增殖活性及抑制与Fn结合的活性进行了研究。 1材科 1．1蕾株和质粒 室保存，pPIC9K-IL．18由本实验室构建。 I，2细胞橡 人脐静脉内皮细胞株ECV304，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心；6—9日龄鸡胚，购自大连韩 伟集团。 1．3主要试搁 DNA聚合酶、14 限制性内切核酸酶、Taq Pharmacia Biotech公司；辣根过氧化物酶标 ConA，购自Sigma公司：Sephadex(3-100。购自Amersham 记的羊抗小鼠IgG，华美生物高科技有限公司产品：IFN-y标准品，上海克隆生物高技术有限公司产品； EC LTD；四甲基偶氮唑盐(MTT)，Amresco产品；其他试剂均为国产分析纯。 2方法与结果 2．1方法 2．1．1 PL-10-ROD的构建 2．1．1．1采用重叠延伸剪切法(splicingbyoverlap 的lL-18突变体(IL．18-RGD)，四条引物分别为： ·通讯作者；赵宝晶Tel：0411 E-mail：zhaobc99@mail．dlmedu．edu．cn 159 上游引物a：5-GCACAAATAAcGGGTTAT|rG-3’； 下游引物b：5’．GAcTGAcAccGclATTACGTGGGGCC．3’； 上游引物C：5-GGCGATAATGcAccccGGACCAT．3’； 引物d进行第二次PCR。最终得到含有RGD序列的突变IL．18序列ad。 PCR反应条件为条件为94℃变性6rain，55℃复性45s，72℃延伸45S，30个循环。 I、Ec052 ad片段和质粒pPIC9K分别应用EcoR I、Ec052 I进行 烈酶切后PCR鉴定”J。 2．1．1．2阳性质粒插入片段核苷酸序列分析采用双脱氧末端终止法，由大连宝生物T程公司完成。 2 1．2酵母转化及分型和鉴定 I酶切线性化厉行1％琼脂糖屯 2．1．2．1酵母转化重组质粒pPIC9K．IL．18．RGD和pPIC9K．II。．18经Sac v／cm、10 胞混合，进行电击转化(参数为7500 ms)。然后，200 生物素，2％葡萄糖)，28—30℃过夜培养，直到长出菌落。 2．1．2．2 生物素，O．5％甲醇)和MD平板上，根据在MM和MD平板上生长速度筛选表型。 鉴定阳性菌落。 21．3重组蛋白的诱导表达和鉴定 母粉，2％蛋白胨Y，1．34％酵母氮源，4×lO-5％生物素，l％甘油，0．1